文档介绍：PCR基因扩增原理
PCR 基因扩增实验原理﹑仪器试剂和操作步骤
实验原理:PCR(Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应,可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是,首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链,DNA样品中,特异性的引物能够与其互补的序列杂交,在dNTPs和Taq酶存在时,就可以合成模板 DNA的互补链,反应完成后,将反应混合物加热使DNA双链变性,温度下降后,过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸—变性—退火—延伸的循环可以重复多次,使所需要的DN***段得到特异性的扩增。
:加热使模板DNA在高温下(94℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链。
:使溶液温度降至50~60℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.
:溶液反应温度升至72℃,耐热DNA 聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合
物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs),按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA
上述3 步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、
dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
影响PCR的主要因素
PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA,然后才进行自动热循环,最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行,临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作,PCR自动热循环中影响因素很多,对不同的DNA样品,PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数在PCR自动热循环中,最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示,其变性、退火、延伸的条件是:94℃60s, 37℃60s, 72℃120s,共25~30个循环,扩增片段500bp。在这里,每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30~60s,这一迟滞时间的长短取决于几个因素,包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源(水浴或加热块)以及两步骤间的温度差,在设置热循环时应充分给以重视和考虑,对每一仪器均应进行实测。
关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离;距离越远,合成靶序列全长所需的时间也越长,前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。
,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。一般取90~95℃。样品一
旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种,时间过久没有必要;反之,在高温时间应尽量缩短,以保持Taq DNA聚合酶的活力,加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。
;温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产
物增加。一般先由37℃反应条件开始,设置一系列对照反应,以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的(G+C)%含量进行推测,把握试验的起始点,一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃,可按公式进行计算:
Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃
其中A,T,G,C分别表示相应碱基的个数。例如,20个碱基的引物,如果(G+C)%含量为50%时,则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时(),退火反应数秒即可完成,长时间退火没有必要。
DNA聚合酶的最适温度。一般取70~75℃,在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35~100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度,其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp,则可省略延伸这一步,而成为双温循环,因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100~300bp之间的短序列片段,采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时,引物延伸温度与退火温度相同。对于
1kb以上的DN***段,可根据片段