文档介绍：PCR 基因扩增
摘要: PCR 基因扩增受到各种反应要素
(引物、酶、 dNTP 、模板和 Mg2 )和反应
条件(为温度、时间和循环次数)的影响,
在标准反应中采用三温度点法,双链 DNA
在 90 ~ 95 ℃变性 (通常为 94 ℃,1min ),
再迅速冷却至 40 ~ 60 ℃(通常为 ,55 ℃,
1min ),引物退火并结合到靶序列上,然
后快速升温至 70 ~ 75 ℃(通常为 72 ℃,
2min ),在 Taq DNA 聚合酶的作用下,
使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因 ( 长
度为 100 ~ 300bp 时) 可采用二温度点法,
除变性温度外、退火与延伸温度可合二为
一,一般采用 94 ℃变性, 65 ℃左右退火与
延伸 ( 此温度 Taq DNA 酶 仍有较高的催
化活性 ) 。 循环次数为 30 次。
关键词: PCR ; 聚合酶链式;反应条件;
影响;温度
聚合酶链式反应简称 PCR (英文全称:
Polymerase Chain Reaction ),是体外
酶促合成特异 DNA 片段的一种方法 , 由 高
温 变性、低温退火及适温延伸等几步反应
组成一个周期 , 循环进行 , 使目的 DNA 得以
迅速扩增 ,具有 特异性强、灵敏度高、操
作简便、省时等特点。它不仅可用于基因
分离、克隆和核酸序列分析等基础研究 ,还
可用于疾病的诊断或任何有 DNA,RNA 的
( Polymerase
Chain Reaction ,简称 PCR )又称无细胞
分子克隆或特异性 DNA 序列体外引物定向
酶促扩增技术。
DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重
要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可以
变性解链成单链,在 DNA 聚合酶与启动
子的参与下, 根据 碱基互补配对原则复制
成同样的两分子挎贝。在实验中发现, DNA
在高温时也可以发生变性解链, 当温度降低
后又可以复性成为双链。因此,通过温度变
化控制 DNA 的变性和复性,并设计引物做
启动子,加入 DNA 聚合酶、 dNTP 就可以
完成特定基因的体外复制。
但是, DNA 聚合酶在高温时会失活,因此,
每次循环都得加入新的   DNA 聚合酶,不仅
操作烦琐,而且价格昂贵,制约了    PCR 技
术的应用和发展。发现耐热   DNA 聚合同酶
--Taq 酶对于 PCR 的应用有里程碑的意义,
该酶可以耐受  90 ℃以上的高温而不失活,
不需要每个循环加酶,使   PCR 技术变得非
常简捷、 同时也大大降低了成本,  PCR 技术
得以大量应用,并逐步应用于临床。
类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性
依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性 -- 退火 ( 复性) -- 延伸三个基本
反应步骤构成:①   模板 DNA 的变性:模
板 DNA 经加热至 93 ℃左右一定时间后, 使
模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链
DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物
结合,为下轮反应作准备;②模板    DNA 与
引物的退火 ( 复性 ) :模板 DNA 经加热变性
成单