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使用脂肪酶制备水凝胶的方法
本发明涉及一种改进的用于制备水凝胶,例如藻酸盐水凝胶的方法。本发明的水凝胶特别用于生物材料,例如细胞材料,如精子的固定和保存。
【专利说明】使用脂肪酶制备水凝胶的方法发明领域
[0001]本发明涉及一种改进的用于制备水凝胶,特别是藻酸盐水凝胶的方法。本发明的水凝胶具有广泛的应用领域,并且特别用于生物材料的固定化,更具体而言,用于细胞物质例如精子的固定化和保存。
[0002]发明背景
[0003]水凝胶由形成亲水性的含水网络的聚合物链构成,其在多个工业领域,特别是生物技术和制药业中具有广泛的应用。例如,水凝胶被用于固定生物材料(例如细胞)以用于移植或作为例如药物活性成分或营养成分的递送系统。水凝胶也可以用作伤口敷料。此夕卜,水凝胶,特别是藻酸盐水凝胶,被广泛地用作增稠剂。
[0004]广泛使用的用于形成水凝胶的聚合物为藻酸盐。藻酸盐为天然存在的阴离子多糖,其由1,4-联-β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-葡萄糖醛酸(G)构成(Smidsr0dandSkj&k-Braek,1990,Trendsinbiotechnology,第8卷,第3期,第71-78页)。市售的藻酸盐提取自海藻,例如褐藻(
Ascophyllumnodosum)、巨藻(Macrocystispyrifera)和北极海带(Laminariahyperborea),部分提取自扎掌状海带(Laminariadigitata)、福建种海带(Laminariajaponica)、Ecloniamaxima、Lesonianegrescens和马尾藻(Sargassumsp)。
[0005]藻酸盐还可由一些藻酸盐产生菌制备,例如由一些假单胞菌属(Pseudomonasspecies)以及由棕色固氮菌制备(Azotobactervinelandii)(Smidsr0dandSkjak-Braek,1990,supra)〇
[0006]藻酸盐通常尤其用于食品工业,例如作为用于粘度控制的稳定剂,或作为增稠剂。藻酸盐还可广泛地用于制药业和化妆品业,同样作为稳定剂、增稠剂或分解剂。基于不同目的,可分别获得富含古罗糖醒酸(guluronicacid)或甘露糖醒酸的藻酸盐(Mancini等(1999),JournalofFoodEngineering39,369-378、W08603781、US4,990,601、US5,639,467)。
[0007]由于在二价阳离子例如钙离子的存在下藻酸盐的生物相容性和凝胶能力,藻酸盐通常还可用于细胞的胶囊化(Nebel,.,Balme,J.,Saacke,.(1985),:1631-1639;Lim,F和Sun,·,(1980)Science210:908-9100;W02006/106400;EP0922451;US6596310;Torre等(1998),
,8(4),第233-236页;Torre等,(2000),Biomaterials,21,第1493-1498页;Torre等(2002),JournalofControlledRelease,85,第83-89页;Faustini等,(2004),Theriogenology,61,第173-184页;Weber等(2006),JournalofBiotechnology,123,第155-163页。
[0008]藻酸盐凝胶还用于固定各种材料。例如,W02008/004890记载用于保存精子的生物聚合物颗粒,并且其中生物材料被包埋在呈固态的聚合物颗粒中,并贯穿在整个颗粒的直径中。通过将精子包埋在藻酸盐水凝胶中而不是将精子胶囊化,使得精子保存于胶囊的流体芯中,细胞被固定在藻酸盐凝胶网络中,因此限制了细胞在存储过程中的运动性。
[0009]藻酸盐水凝胶,例如用于各种材料的胶囊化或圈闭(entrapment)的藻酸盐凝胶,可以通过以下方法制备:将待圈闭的材料的溶液与海藻酸钠的溶液混合,然后将该溶液加入到含有多价阳离子的溶液中,所述多价阳离子通常为二价阳离子例如钙离子(例如CaCl2的溶液)(Sn丨idsredandSkjak-Braek,1990,supra)〇
[0010]US6,497,902公开了另一种制备生物相容性水凝胶(例如藻酸盐水凝胶)的方法,其包含将待包埋的细胞、藻酸盐和钙释放剂彼此混合,之后将钙释放化合物加入到所述混
合物中形成交联凝胶。根据US专利6,497,902,所述钙释放剂可以是D-葡萄糖-δ-内酯^DL)。
[0011]在US专利6,497,902中公开的方法可用来固定用于人工授精的精子(例如,用于制备公开于W02008/004890的藻酸盐水凝胶)。例如,稀释并冷却(4°C)的精子可被加入到包含溶解的海藻酸钠和悬浮的碳酸钙以及任选地冷冻保护剂(例如甘油)的溶液中,然后通过加入包含GDL的溶液引发胶凝并获得所需的藻酸盐水凝胶。GDL的加入导致葡萄糖酸的形成,葡萄糖酸将与水反应而形成H30+。H30+的增加,以及碳酸钙的存在导致了C02和Ca2+的释放。通过加入GDL而提供的Ca2+导致含有包埋的精子的藻酸盐水凝胶的形成。
[0012]在凝胶已发生之后,充满包埋在藻酸盐中的精子的容器可冷藏保存在液氮中,由此提供了具有特别长的保质期的精子的冷藏保存。
[0013]然而,本发明人已体验到在根据US专利6,497,902中公开的方法制备藻酸盐水凝胶中使用⑶L包括一些缺陷。当根据上述方法制备包含固定的精子的藻酸盐凝胶时,在制备GDL溶液后立即将其加入溶液以避免自发的胶凝是关键的。GDL必须以溶解的形式加入而不是粉末的形式,从而避免最初局部区域/层区具有高浓度的葡萄糖酸,这将对精子不利。此外,在GDL加入之后,胶凝反应开始后将伴随一段粘度升高的时期。由于粘度的增加,
用于形成水凝胶的容器必须相当快地被充满。在将溶解的GDL转化葡萄糖醛酸的累积时间中,溶液因此被转移到适合的容器(例如,頂V,L'Aigle,France提供的微型吸管)以使所需的生物材料进一步胶凝和固定化。因此,现有技术中公开的方法确实导致制备包含所需生物材料的水凝胶的时间安排相当短且不灵活并且从工业的角度来看是主要的缺点。
[0014]由于上述方法的缺点,需要改进水凝胶的制备方法,特别是适合在工业规模上制备水凝胶的方法。
[0015]在现有技术中,已经记载制备水凝胶的各种其他方法。各种报道公开了一种酶的利用,所述酶在接触特定底物时提供了不同的反应,所述反应最终导致各种类型聚合物的交叉联(crossbinding)。
[0016]例如,CN101439206公开了尤其是在酶催化方法中使用包含酚羟基单元和二氧化酶的聚合物以制备聚合物凝胶。
[0017]Johnsen等(2010)在ACSAppliedMaterials&Interfaces,2(7),第1963-1972页中报道了使用葡萄糖氧化酶进行聚合的基于PEG的水凝胶的制备。葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖的氧化,随后使用氧气来产生黄素腺嘌呤二核苷酸酶辅助因子,导致H202的生成。通过亚铁离子与这些酶催化的H202产物的结合,产生伯羟基基团物质,其进一步与丙烯酸酯单体反应。
[0018]还已报道了H202和辣根过氧化物酶在水凝胶制备中的用途,参见例如Kurisawa等,(2010),,20(26),第5371-5375页;Sakai等,(2009),Biomaterials,30(20),第3371-3377页;SakaiandKawakami(2006),ActaBiomaterialia,20017,3,第495-501页;Lee等(2009),,134,第186-193页;Wang等(2010),Biomaterials,31,第1148-1157页。
[0019]由于H202是强氧化剂,通过使用氧化酶和H202制备的水凝胶并不适合某些应用。
[0020]因此,仍需要改进且简化的用于制备藻酸盐水凝胶,特别是适合于固定化生物材料的水凝胶的方法。
[0021]发明概述
[0022]本发明的目的是提供一种改进的用于制备藻酸盐水凝胶的方法,其不具有现有技术的方法的缺点。
[0023]本发明的另一个目的是提供一种简化的用于制备藻酸盐水凝胶的方法,该藻酸盐水凝胶适合于固定生物材料。
[0024]因此,本发明涉及一种藻酸盐水凝胶,其中其胶凝是通过以下方法进行引发:利用水解酶和可被水解酶水解的底物来形成H30+、并随后由于二价阳离子释放剂的存在而释放二价阳离子。
[0025]根据本发明的一个方面,提供了一种制备藻酸盐水凝胶的方法,所述方法包括将
含有水解酶的溶液与含有可被水解酶水解的底物的溶液混合,其中所述含有水解酶的溶液或含有可被水解酶水解的底物的溶液另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。在两种溶液混合时,底物与水解酶结合导致所述底物的水解并随后形成H30+。此外,H30+的产生导致二价阳离子的释放,由此引发了水凝胶的形成。
[0026]根据一个实施方案,二价阳离子释放化合物和藻酸盐存在于包含水凝胶的溶液中。根据另一个实施方案,二价阳离子释放化合物和藻酸盐存在于包含所述底物的溶液中。
[0027]所述水解酶可以是酯酶,例如脂肪酶。根据本发明的一个实施方案,本发明的方法中使用水解酶为三酰基甘油脂肪酶。
[0028]根据本发明的又一个实施方案,二价阳离子释放化合物释放选自Ca2+、Ba2+、和Sr2+的二价阳离子。
[0029]根据本发明的另一个实施方案,二价阳离子释放化合物为钙释放化合物,例如碳酸钙。
[0030]根据本发明的又一个实施方案,底物为有机酸的酯。
[0031]根据本发明的又一个实施方案,提供一种方法,其包含以下步骤:将含有三酰基甘油脂肪酶的溶液与包含可被所述水解酶水解的底物的溶液进行混合,其中底物为式I的化合物:
[0032]
【权利要求】
。
,其中所述酶为酯酶。
,其中所述酯酶为脂肪酶。
,其中所述脂肪酶为三酰基甘油脂肪酶。
,其中所述水解酶的底物的水解导致成0+的产生。
,其中所述酶为脂肪酶并且所述底物为式I的化合物:
其中Ri、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的Q-Cu-烷基羰基链。
,其中^、馬和馬选自甲***、乙***、***、丁***、戊***、己***、庚***、辛***、壬***、癸***、十二烷***。
,其中RpR2和R3独立地相同或不同并代表Ci-Q-烷基羰基链。
,其中所述底物选自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯,优选三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
,其中所述酶和底物用于制备包埋生物材料、优选精子的藻酸盐水凝胶。
,包含以下步骤:将含有水解酶的溶液与含有可被该水解酶水解的底物的溶液混合,并且其中含有所述水解酶的溶液或含有所述底物的溶液另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。
,其中包含水解酶的溶液含有二价阳离子释放化合物和藻酸盐。
,其中包含底物的溶液含有二价阳离子释放化合物和藻酸盐。
,其中所述水解酶为酯酶。
,其中所述酯酶为脂肪酶,优选三酰基甘油脂肪酶。
-13中任一项的方法,其中所述底物为有机酸的酯。
-13中任一项的方法,用于制备藻酸盐水凝胶,包含以下步骤:将含有三酰基甘油脂肪酶的溶液与包含可被该水解酶水解的底物的溶液混合,其中所述底物为式I的化合物:
其中Ri、R2和R3独立地相同或不同并代表直链或支链、取代或未取代的Q-Cu-烷基羰基链,并且其中包含所述脂肪酶的溶液或包含式I化合物的溶液另外地包含藻酸盐和二价阳离子释放化合物。
,其中^、馬和馬选自甲***、乙***、***、丁***、戊***、己***、庚***、
辛***、壬***、癸***、十二烷***。
,其中RpRjPR3独立地相同或不同并代表烷基羰基链。
-16中任一项的方法,其中所述底物选自三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯,优选三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
-17中任一项的方法,其中所述二价阳离子释放化合物释放选自Ca2+、Ba2+、和Sr2+的二价阳离子。
,其中所述二价阳离子释放化合物为钙释放化合物。
,其中所述阳离子释放化合物为碳酸钙。
-21中任一项的方法,其中第一溶液还包含待包埋在藻酸盐水凝胶中的目标物。
,其中待包埋在藻酸盐凝胶中的目标物为生物材料。
,其中所述生物材料为精子。
,其中所述方法包含以下步骤:i)通过用包含三酰基甘油脂肪酶的溶液稀释精子而形成第一溶液;ii)将包含藻酸盐、二价阳离子释放化合物和式I化合物的第二溶液加入到在步骤i)中获得的第一溶液中,引发胶凝: