文档介绍：重组DNA技术
DNA bination Technique
重组DNA技术的发展史
年
1944年
1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子
1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司,专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。
1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂
1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉
一、相关概念
DNA克隆
工具酶
目的基因
基因载体
二、基本原理及操作步骤
本节主要内容
一、重组DNA技术相关概念
克隆(clone)
来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning),即无性繁殖。
(一) DNA克隆
DNA克隆
应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克隆或重组DNA (binant DNA) 。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。
目的
①分离获得某一目的基因或DNA
②获得目的基因的表达产物(蛋白质)
基因工程(ic engineering) ——实现基因克隆所用的方法及相关的工作,又称重组DNA技术。
(二)工具酶
限制性核酸内切酶
DNA聚合酶Ⅰ
逆转录酶
T4DNA连接酶
碱性磷酸酶
末端转移酶
Taq DNA聚合酶
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶
功能
限制性核酸内切酶
识别特异序列,切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键,使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
DNA聚合酶Ⅰ
合成双链cDNA分子或片段连接
缺口平移制作高比活探针
DNA序列分析
填补3´末端
Klenow片段
又名DNA聚合酶I大片段,具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性,而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成,双链DNA 3末端标记等
反转录酶
合成cDNA
替代DNA聚合酶I进行填补,标记或DNA序列分析
多聚核苷酸激酶
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化,或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease)
识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
TAGG
TAG
G
+
Bam HⅠ
作用:
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源DNA, 保护自身DNA。
分类:
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类
(基因工程技术中常用的是Ⅱ类)