文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
诱导小鼠胚胎干细胞分化为内皮细胞及组织工程化血管内皮化
研究
姓名:沈干
申请学位级别:博士
专业:外科学(整形外科)
指导教师:曹谊林
圭塑墨三堕登盔苤骼夹┒檐选!!!!!!!!!!!!!!!!中文摘要诱导小鼠胚胎千细胞分化为内皮细胞及组织工程化血管内皮化研究通过本实验使细胞成为构建组织工程化人工血管的种子细胞来源之~,为组体反应阳性,细胞被接种到裸鼠皮下,测定在体内的分化潜能P∨嘌鳨赴组织工程学是将种子细胞和生物材料复合,构建成为三维的组织结构。因此,种子细胞是组织工程的最基本要素。只有获得足够数量并保持其特定生物学活性的种子细胞,才能保证组织构建的成功。目前,组织工程化组织的构建主要是应用自体组织的同源细胞作为种子细胞来源,存在着来源有限、易老化、不能大规模扩增以及取材对机体造成创伤等问题。胚胎干细胞,蚱渚哂腥苄院臀尴拊鲋车哪芰Γ有望成为组织工程中种子细胞的新来源。胚胎于细胞具有三大特点:⒛艽罅糠敝并保持未分化的状态:⒃谝欢ㄌ跫戮哂邢蛉雠卟内、中和外胚层橹细胞分化的全能性;⒁子诮谢蚋脑觳僮鳌J笛楸砻鳎庑┰嫉母上赴谕界刺激下能够进一步定向分化,成为各种分化缅胞的前体细胞,然后用来替代组织。为了探索胚胎干细胞是否可能作为组织工程中种子细胞,我们将小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为内皮细胞,并尝试将这些内皮细胞用于血管构建。目前俅菜褂玫难9芴娲反嬖谧乓恍┤毕荩诓牧献橹嗳菪浴⒌韵凳顺应性等方面与正常血管存在差距,而且人工血管不具有生长性,所以无法满足低龄组织工程化血管是由细胞材料复合物构建的血管替代品,在生物材料降解后所形成的血管由活细胞所构成,因此具有与正常生理性血管相似的特性,可以随机体的生长两生长虼俗橹こ袒9艿难芯渴悄壳白橹こ塘煊蜓芯咳鹊阒弧N1Vぱ管替代物的通畅率,内皮化是其关键,但目前内皮细胞来源困难。织工程化组织构建开辟新途径。方法本实验室从/∈天的囊胚鴗中分离出内细胞团,,消化,生长在以小鼠胚胎成纤维细胞养层的培养条件下传代并建系,然后进行特性鉴定染色阳性,.琽。,獷冢诤;ひ蜃。患者的需要。甅W天,得到球形胚体目的
圭塑苎三墨型奎兰塑主兰些笙兰一————,的条件培养液中诱导,天后周围生出许多/⒃残蜗赴天时传代,其中一克隆命名为。以猙琍检测端粒酶的表达和活性,大小的希嘌恢芎螅乒杞汗苌现踩肼闶蠖认拢周后,抽出硅胶管,将诱导分化为内皮前体细胞;该分化细胞在转染端粒酶可持续扩增、传代,并保有管状结构形成。将管状结构行免疫细胞化学、扫描电镜、透射电镜检查。同时,建将八端粒酶灾侍宸ㄗH拘≡残蜗赴瓜赴艹中┰,并且以流式细胞仪组织块培养法获取兔动脉平滑肌细胞,大量扩增细胞,以种植在×细胞注射至管腔,旌笕〕龉茏唇峁剐忻庖咦橹А⒌ο宋结果被注射到裸鼠皮下天后能长出畸胎瘤。在诱导条件下从周围分化的圆形细胞组成的管状结构经扫描电镜、透射电镜观察证明其管壁是由小圆细胞组成,免疫组织化学反应证明这些圆形细胞显示内皮前体细胞标志及内皮细胞标志均为阳性。同时细胞也显示了同样的特性。转染了端粒酶的小圆形细胞可以持续扩增、传代,猙允緃的表达,煺∠赴哂泻芮康亩肆C富钚浴C庖呦赴允内皮细胞标志Q粜裕魇较赴呛腿旧宸治黾ㄏ赴诵椭な迪赴结论从痵小鼠囊胚蟹掷虢ㄏ档奈P∈;该细胞成功地使组织工程化血管内皮化。关键诃:胚胎干细胞细胞系诱导分化内皮细胞端粒酶组织工程内皮化系的细胞由绿色荧光蛋白昙呛螅杏盏挤只和染色体分析鉴定细胞核型。由内细胞团消化传代的细胞系旧粜裕琒,抗体反应阳性,细胞为正常核型。裸鼠皮下管状结构组织切片发现管腔内有衬里细胞,免疫组织化学检查证实该层殖能力。细胞在血管染色检查。细胞Q粜浴
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圭塑塑兰至型查兰竖主望些丝整————引言过去十余年来,科学家已经在动物实验中探索细胞是否能在成体器宫中重建,桥咛シ⒂缙凇!D遗受糟后约—的内细胞团中的未分化细胞。整个囊胚含有约鱿赴钔獠闶恰白个胚层时开始分化。每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。如外胚层将分胚胎干细胞细胞系最早建立于年。首先得到的是小鼠的胚胎干细胞。此后,胚胎干细胞建立。年,人的细胞分离成功。细胞在特定的条件培养下能维持未分化状态,具有全能性或多能性;并且在体外具有旺盛而持久的增殖能力。组织。这一系列的研究将成为未来进一