文档介绍：分子生物学实验课件作者:蒋华云PCR扩增产物的鉴定与纯化实验目的通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。对获得的目的产物进行割胶纯化回收,为接下来的DNA重组和转化实验提供外源DN***段。实验原理琼脂糖凝胶电泳检测DNA从琼脂糖凝胶中回收并纯化DN***段AgaroseGelDNAPurificationKitTaKaRa公司的胶纯化试剂盒AgaroseGelDNAPurificationKit从琼脂糖凝胶中回收并纯化DN***段的试剂盒,采用了独特的凝胶融解系统,结合DNA制备膜技术,具有高效、快速、方便的特点,全套操作只需30min便可完成。使用该试剂盒每次可纯化得到多至10µg的DN***段(100bp~30kb),回收率高达50~80%。本试剂盒回收纯化的DN***段纯度高,完整性好,可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。经胶纯化试剂盒回收的DN***段采用-20℃低温保存,延缓DNA的降解。仪器、材料与试剂【仪器】琼脂糖凝胶电泳系统紫外透射仪台式离心机移液枪(配套枪头)-20℃低温冰箱分析天平【材料与试剂】PCR扩增产物AgaroseGelDNAPurificationKit(TaKaRa)琼脂糖1×TAE6×(无菌)实验步骤(1)使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。(参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验)(2)在紫外灯下切出含有目的DNA(约600bp)的琼脂糖凝胶。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶,尽量减小凝胶体积,提高DNA回收率。注意:切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下,以防止DNA损伤。实验步骤(3)切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间,提高DNA的回收率。(4)称量胶块重量,计算胶块体积。计算胶块体积时,以1mg=1µL进行计算。(5)向胶块中加入胶块融化液DR-IBuffer,DR-IBuffer的加量如下表:实验步骤(6)均匀混合后75℃加热,融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热)。此时应间断振荡混合,使胶块充分融化(约6~10分钟)。注意:胶块一定要充分融化,否则将会严重影响DNA的回收率。(7)向上述胶块融化液中加入DR-IBuffer量的1/2体积量的DR-IIBuffer,均匀混合。当分离小于400bp的DN***段时,应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。实验步骤(8)将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。(9)将上述操作7的溶液转移至SpinColumn中,12000rpm离心1min,弃滤液。注意:如将滤液再加入SpinColumn中离心一次,可以提高DNA的回收率。