文档介绍：实验二 PCR 扩增实验三 PCR 产物的纯化实验目的和要求学****和掌握 PCR 基因扩增的原理和操作方法; 学****和掌握从 PCR 产物中回收 DNA 片段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化 DNA 片段的有关技术. 实验原理多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR ) 原理类似于 DNA 的变性和复性过程,即在高温( 93- 95 ℃)下,待扩增的靶 DNA 双链受热变性成为两条单链 DNA 模板;而后在低温( 37 ~ 65 ℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链 DNA 模板结合, 形成部分双链;在 Taq 酶的最适温度( 72 ℃)下,以引物 3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成 DNA 新链。每一双链的 DNA 模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链 DNA 分子。如此反复进行,每一次循环都使两条人工合成的引物间的 DNA 特异区拷贝数扩增一倍, PCR 产物得以 2 n的指数形式迅速扩增,经过 25 ~ 30 个循环后,理论上可使基因扩增 109 倍以上,实际上一般可达 106 ~ 107 倍。?PCR 反应系统的组成引物、 dNTPs 、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA 、缓冲液。 PCR 仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。材料与试剂材料与试剂实验步骤实验步骤?PCR 反应体系(每人3小管) 模板 DNA ul (10ng) 引物 (10uM) 引物 ul (10uM) dNTPs 1 ul (1mM) Taq DNA 聚合酶 ul(5U/ul) 10×缓冲液(Mg2+) 3 ul 去离子水 25 ul 总反应体系 30ul 94℃变性 5min 后,开始以下循环: 94℃变性反应 40s 55℃退火反应 30s 72℃延伸反应 1min 最后 72℃反应 2min 3 32个循环 2个循环 PCR PCR 反应条件反应条件 PCR PCR 产物电泳检测产物电泳检测?PCR 产物分析取5ul PCR 产物,采用 1%琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准 DNA 的量粗略计算 PCR 产物的总量。?学生 PCR 实验结果产物中直接回收纯化 DNA ( Promega 公司) 1) 直接加 100 μl 纯化缓冲液于离心管,再加入 30~300 μl PCR 反应物; 2)进入 C步骤。回收 PCR 产物常采用两种方法,即直接回收和从凝胶中回收,目前有许多公司出售相关的试剂盒。 DNA 回收纯化