文档介绍：实验八 SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
一、目的要求
-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离鉴定蛋白质技术
二、原理
电泳:带电质点在电场作用下,会向两极移动;带正电荷的移向负极,带负电荷的移向正极,这种现象称为电泳。
氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团,它们在溶液中会解离而带电。一般说来,在碱性溶液中(即溶液的pH值大于等电点pI),分子带负电荷,在电场中向正极移动。而在酸性溶液中,分子带正电荷,在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。
不同的质点在同一电场中泳动速度不同,常用泳动度(或迁移率)来表示。泳动度的定义是带电质点在单位电场强度下的泳动速度。
泳动度(或迁移率)首先取决于带电质点的性质,即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说,质点所带净电荷越多,质点直径越小,越接近于球形,则在电场中的泳动速度越快;反之,则越慢。
泳动度除受质点本身性质的影响外,还受其他外界因素的影响。
影响泳动速度的主要外界因素有溶液的粘度、电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗现象
类别
名称
形式
用支持物的电泳技术
支持物有:淀粉、纤维素粉、玻璃粉、硅胶、合成树脂粉末
(1)淀粉凝胶
(2)聚丙烯酰胺凝胶
1)圆盘电泳
2)平板电泳
3)SDS-圆盘电泳
(3)琼脂糖凝胶电泳
(4)琼脂凝胶电泳
包括常压、高压电泳
(水平式或垂直式)
水平式事垂直式
(平板法、柱状法)
垂直式(柱状法)
垂直式或水平式
垂直式(测相对分子质量)
平板法或柱状法(如免疫电泳)
表电泳技术的种类
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N,N,N,N—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)。
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性:
(1)在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好;
(2)化学性能稳定,与被分离物不起化学反应,在很多溶剂中不溶;
(3)对pH和温度变化较稳定;
(4)几乎无吸附和电渗作用,只要Acr纯度高,操作条件一致,则样品分离重复性好;
(5)样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达10-6g
(6)凝胶孔径可调节,根据被分离物的分子量选择合适的浓度,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径;
(7)分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围适用的凝胶浓度/(%)
蛋白质
104 20-30
1-4×104 15-20
1-5×104-1×105 10-15
1×105 5-10
5×105 2-5
核酸(RNA)
104 15–20
104–105 5-10
105-2×106 2-
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。
目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2),两者电泳原理完全相同。
图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1) (2) (3) (4)