文档介绍：:..per扩增实验报告增实验报告篇一:DNA提取及PCR扩PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428环墟科学一、。,并分析相应结果。二、实验原理Si1PCR扩增多聚酶链反应(PCR)技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液,加入微量模板DNA、四种脱氧核昔酸(dNTP)、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物,而后加热使模板DNA在高温下(94°C)变性,双链解链,这是所谓变性阶段。降低溶液温度,使合成引物在低温(55°C)与模板DNA互补退火形成部分双链,这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温(72°C),在Tap酶作用下,用四种dNTP为原料,引物%复希屉皆,檢板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链,这是延伸阶段。如此反复,在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环,使产物DNA重复合成,并在重复过程中,前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成,使产物DNA的量按指数方式扩增。经过30〜40个循环,DNA扩增即可完成。,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛兹应,即分手本身葩大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在淙动時的直荷效血和分字筛效应,达到分离混合物的目的。三、实验材料仪器:PCR扩增仪、0・2ul薄壁管、l・5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射役。试剂:TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全丧DNA样本、无菌ddH20、模板DNA、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。四、。,、1uldNTP、>、>,并分别添加8种不同的模版,并于第9个薄壁管中加入无菌ddH20作为阴性对照。,按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到30F0次。程序如下:预变性:94°C3min宿环:94°C变性30s55°C退火30s72C延彳申30s末次延伸:,将样品取出并保存于15°C环境中。,放到一锥形瓶中,。然后置微波炉加热至完全溶化,溶液透明。摇匀,待冷却至60°C左右,,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已冷至60°C左右的胶液,使之形成均匀水平的胶面。,小心拔起梳子,使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。,至液面覆盖过胶面。取1卩1缓冲液和5UI特测DNA样品混合后,用彩液枪滴加至凝胶的加样孔中。,并接通电源,调节稳压输出,电压最高不超过5V/cm,开始去泳。点律端故胡祓端。根据经验调节电压使分带清晰。(蓝色)的移动。当其移动至距胶板前沿约lcm处,可停止电泳。1=***仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜,赶去气泡平铺,然后把凝胶放在上面。关上样品室外门,打开紫外灯,通过观察孔进行观察。蓝、实验结果鸟讨论如图所示:从左至右,分别是模版1-8#,第9列为阴性对照。前8列均有明显的条带出现,而阴性对照无显示,说明扩增整体效果很好。图中有上下两条线,上面一条线所覆盖的条带基本可以代表扩增的产生的片段位置,参照图可以看出扩增片段在200bp左右。在第9个阴性对照的第二条线处可以看到较为模糊的条带,并非是出现假阴性,而是由于二聚物而产生的条带。通过该条带与最右侧的marker对比可知该片段出现在lOObp左右,并非由于实验操作等问题而产生的污染。实验前照片显示实验结果有拖尾现象,但是并不影响后续实验。在实验过程中由于有些试剂加到了管壁上面,并没有完全加入,可能会出现一些差。另外在第1列条带中出现了其他的亮带,可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增,