文档介绍：pcr扩增实验报告
篇一:DNA提取及PCR扩增实验报告
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳
刘琳 1131428 环境科学
一、实验目的
1(学****并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2(对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理
1. PCR扩增
多聚酶链反应(PCR)技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸(dNTP)、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下(94?)变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温(55?)与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温
(72?)，在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。经过30,40个循环，DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
三、实验材料
仪器:PCR扩增仪、、、移液枪、枪头、微波炉、
电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂: TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。
四、 实验步骤
1. PCR扩增
本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。
根据计算， 10×Buffer 、1 ul dNTP、 ul
341GC、 ul 534、 ul Taq、
ddH2O的比例配置足量的PCR反应体系。
分别向9个薄壁管中分别加入24 ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。
将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到30~40次。程序如下:
预变性: 94? 3min
循环: 94? 变性30s
55? 退火30s
72? 延伸30s
末次延伸:72? 5min
PCR扩增完成后，将样品取出并保存于15?环境中。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验
，放到一锥形瓶中，×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至60?左右，在胶液内加入适量的EB。
取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60?左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。
待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取1μl缓冲液和5μl待测DNA样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。
接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。
观察溴酚兰的带(蓝色)的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。
在紫外***仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。
五、实验结果与讨论
如图所示:从左至右，分别是模版
1-8号，第9列为阴性对照。
前8列均有明显的条带出现，而阴
性对照无显示，说明扩增整体效果很
好。图中有上下两条线，上面一条线所
覆盖的条带基本可以代表扩增的产生
的片段位置，参照图可以看出扩增片段
在200bp左右。在第9个阴性对照的第
二条线处可以看到较为模糊的条带，并
非是出现假阴性，而是由于二聚物而产
生的条带。通过该条带与最右侧的
marker对比可知该片段出现在100bp左
右，并非由于实验操作等问题而产生的