文档介绍：第二军医大学硕士学位论文摘要疟疾目前仍然是严重威胁人类健康的寄生虫病,由于疟原虫抗药性以及蚊媒抗杀虫剂的产生和扩散,使疟疾防治面幅严重困难。因此,研制有效的疟疾疫苗已成为疟疾防治重要潜在的替代途径。研制疟疾红内期疫苗对降低疟疾的发病率和死亡率具有重要作用。针对红内期原虫免疫保护机制的研究,早期工作主要集中在体液免疫的作用。事实上红内期原虫确能诱导产生保护性抗体,这类抗体在体外能完全抑制疟原虫生长,许多动物试验结果也表明抗体在清除红内期原虫感染中发挥重要作用。由于红细胞表面缺乏MHc分子,因此细胞毒性T淋巴细胞(cTL)对红内期原虫不能发挥效应作用。但实验表明,在B细胞缺陷的小鼠模型中进行免疫攻击感染试验,结果显示免疫小鼠能产生对疟原虫攻击感染的免疫保护效力。尽管这种免疫力不能完全清除攻击感染的疟原虫,但可控制原虫密度在很低水平。显然,该免疫保护效力是由细胞免疫介导的。此外,cD旷T细胞过继免疫小鼠也能对疟原虫攻击感染产生保护作用。这些结果表明在疟原虫的红内期免疫机制中,体液免疫和CD4+T细胞介导的细胞免疫均发挥重要的作用。近年来,许多红内期疫苗候选抗原陆续得到鉴定,但这些抗原中绝大多数是针对保护性体液免疫的抗原。最近Mal【obongo等将所有红内期原虫抗原进行组分化并建立各组分的cD4+T细胞品系,通过过继免疫和攻击感染试验确定了具有保护保护作用的T细胞品系,并初步鉴定疟原虫次黄嘌呤一鸟嘌呤一黄嘌呤一磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguaninex孤tllinephosph耐bosyltransfemse,HGxPRT)为这种保护性CD4+T细胞的靶抗原。HGxPRT是嘌呤核苷酸补救合成途径中的一个酶,(PRPP)与嘌呤反应生成嘌呤核苷酸。在哺乳动物体内,除有补救合成途径外,还有嘌呤核苷酸从头合成途径,但在疟原虫仅有补救合成途径,只能利用补救途径合成生命所必需的核苷酸,故而HGxPRT对于疟原虫便显得尤为重要,成为广泛关注的抗疟疾药物的靶标。因此有必要制备重组蛋白建立特异T细胞品系,以进一步确定其细胞免疫的免疫保护作用,并在此基础上鉴定其保护性T细胞表位。本实验室利用毕氏酵母系统表达并纯化了恶性疟原虫HGxPRT重组蛋白,第二军医大学硕士学位论文sDS—PAGE显示其分子量约为25KD,。westemBlot检测该重组蛋白可与疫区患者血清反应。本研究在此基础上,将HGxPRT重组蛋白与完全弗氏佐剂(cFA)乳化并免疫B删c小鼠,在第四和第六周以不完全弗氏佐剂(1FA)乳化蛋白加强免疫两次,并设立小牛血清白蛋白(BSA)和PBS对照组,在末次免疫10天后用约氏疟原虫进行攻击感染,自感染次日起,每日制备薄血膜镜检原虫率。结果显示对照组小鼠在攻击感染后20天全部死亡,而免疫组50%小鼠能存活并痊愈,原虫密度峰值低于对照组。EUSA结果显示,三次免疫血清抗体滴度次第升高,至末次免疫时可达105以上。为研究HGXPRT抗原的细胞免疫作用,我们建立了HGxPRT特异性的T细胞品系。用重组HGⅪ,RT蛋白免疫BAuI/c小鼠双侧上肢、双足垫和腹膜内,7。10天后取腋下、腹股沟、胭窝淋巴结和脾脏制备单细胞悬液进行体外培养。在培养物中加入浓度为靴g/ml的HGxPRT抗原刺激,培养7天(此阶段培养称刺激期)。此后,更换新鲜完全1640培养基,加入适量饲养细胞及10u加l的小鼠I【厂2,但不加抗原,继续培养7天(此阶段培养称间歇期):7天后再更换1640培养基,并加入抗原、饲养细胞和小鼠IL2,培养7天。,根据细胞增殖情况,分瓶传代。同时以小牛血清白蛋白(BSA)作为对照,建立BsA特异性的T淋巴细胞系。采用【3H】一TdR掺入法检测各TF细胞系的淋巴细胞增殖情况。结果显示在HGxPRT的刺激下,淋巴细胞出现了明显的增殖,cpm均值为100,,明显高于HGXPRT抗原致敏的小鼠脾脏及淋巴结细胞的增殖(cpm为6,205),-束0激循环,已成功建立HGⅪ,RT特异T细胞品系。为表明HGxPRT特异T细胞的免疫保护作用,我们开展了过继免疫疟原虫攻击实验。实验分为三组,分别为HGxPRT特异性的T淋巴细胞组、BsA特异的T淋巴细胞组、PBs组,每组5只裸鼠。经尾静脉注射T细胞,剂量为10’7细胞/只、PBs组为10叽lPBs/只。24h后,静脉注射105约氏疟原虫感染的红细胞进行攻击感染,次日起每日制备薄血膜镜检原虫率。三组原虫率比较显示对照组原虫率上升急速,BSA组和PBS组原虫率峰值分别出现在感染后第14和第7天,%%,而HGxPRT组原虫率较为平缓,峰值出现在感染后第28天,原虫率为68