文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
RNA干扰在小鼠体内抑制乙型肝炎病毒的表达
姓名:史川
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:沈关心
20090501
华中科技大学硕士学位论文

RNA 干扰在小鼠体内抑制乙型肝炎病毒的表达

硕士研究生:史川
导师:沈关心教授

中文摘要

目的
乙型肝炎病毒(HBV)感染是人类肝硬化和肝细胞癌最主要的危险因素。
本研究通过小鼠尾静脉高速大量注射含有 HBV 全基因组真核表达质粒制作 HBV
感染模型,并注射 HBV siRNA,检测其干扰效果,为进一步研究其干扰与免疫
效应机制奠定基础。

方法
1. 通过小鼠尾静脉高速大量注射含有 HBV 全基因组真核表达质粒制作 HBV
感染模型, 处理后第四天,分别用量效关系,时效关系和三种成像系统观察质粒
pGenesil – hk 的 GFP 表达,验证模型建立是否成功。
siRNA 干扰前后的小鼠血清中分泌型乙型肝炎
表面抗原(HBsAg)和 e 抗原(HBeAg),肝细胞总 RNA 采用实时荧光定量 PCR
检测,肝组织免疫组织化学检测 HBcAg。

结果
1. 小鼠 HBV 感染模型的建立
通过小鼠尾静脉高速注射 HBV 表达质粒后 4 天,定量检测 HBsAg 和 HbeAg
结果表明随着 pBlue-HBV 的量逐渐增加,HBeAg 的量随之上升;肝脏细胞进行
流式细胞术从 2 到 9 天均有不同程度的表达,第 3 到 5 天是表达高峰期。体内成
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华中科技大学硕士学位论文

像结果显示小鼠肝脏有绿色荧光表达,而正常小鼠则未见荧光信号。由此,我们
可以确定高压水动力注射法建立 HBV 感染小鼠模型,肝脏大量表达 HBV,血清
中检测到 HBsAg 和 HBeAg,且于 3 到 5 天为表达高峰,可持续约 10 天。
siRNA 的干扰效果
Realtime PCR 的结果表明 siRNA 组则明显抑制 HBsAg 和 HBeAg 的表达。
说明所构建的 siRNA 体内在 mRNA 水平有效地抑制 HBV 的表达;时间分辨荧
光法检测结果提示,pGenesil-1 和 pGenesil-2 组 HBsAg 和 HBeAg 表达明显下降,
说明 siRNA 能够有效抑制 HBV 相关抗原的表达,进一步免疫组化检测的结果表
明未干扰组可见有较多阳性细胞,而在 pGenesil-1 和 2 组则几乎未见阳性细胞,
说明 siRNA 可有效抑制 HBcAg 的表达。

结论
通过高压水动力注射法成功建立 HBV 感染小鼠模型,肝脏大量表达 HBV,
血清中检测到 HBsAg 和 HBeAg。同样方法注射 HBV siRNA 体内能够有效抑制
HBV 相关 mRNA 及其抗原的表达,以及肝细胞内 HBcAg 的表达,为进一步体
内靶向干扰与免疫效应机制研究奠定了基础。

关键词:乙型肝炎病毒,RNA 干扰,高压水动力尾静脉注射
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华中科技大学硕士学位论文

Inhibition of Hepatitis B virus expression
In mice by RNAi

Candidate:Chuan Shi
Supervisor: Shen

Abstract

Objective:
Hepatitis B virus (HBV) infection is the crucial risk of chronic liver disease and
hepatocellular carcinoma in humans. In this study, model was constructed by
hydrodynamic tail vein injection method, meanwhile mice received shRNA vector.
This interference may be foundation of advance research on immunological effect.

Methods:
1 Mice received HBV genome plasmid by hydrodynamic tail vein injection
method and killed on the 4th day. We evaluated whether Model was essfu