文档介绍：华中科技大学
博士学位论文
商陆抗病毒蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的研究
姓名:陈西柳
申请学位级别:博士
专业:内科学(传染病)
指导教师:贺永文
2011-05
华中科技大学博士学位论文
商陆抗病毒蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的研究
华中科技大学同济医学院附属协和医院感染性疾病科
博士研究生:陈西柳
导师:贺永文教授
中文摘要
第一部分天然 PAP-S 的制备及其毒性研究
目的:从美洲商陆种子中提取天然 PAP-S,研究其对小鼠的急性及亚急性毒性。
方法:采集美洲商陆种子,粉碎后加蒸馏水搅拌离心。上清液通过酸碱柱
CM-Sephadex C-50分离酸性及碱性蛋白,碱性蛋白通过分子筛 Sehpadex G-50柱收集
第一洗脱峰,浓缩后通过酸碱柱 CM-Sephadex C-52 再次分离酸碱性蛋白,收集第二
洗脱峰。SDS-PAGE 检测分子量,BCA 法测定蛋白质浓度。将 80 只昆明小鼠随机分为 8
组,单次腹腔注射 PAP-S,每组浓度分别为 、、1、、2、、4、,
观察注射后 14 天内小鼠的健康状况及死亡率。40 只昆明小鼠随机分为 4 组,连续 14
天腹腔注射 PAP-S,浓度分别为 0、、、,停药一天后采血检测血
清 ALT、BUN 水平,取肝、肾组织做 HE 染色。
结果: 洗脱后得到分子量约为 30KD 的单一条带,冻干后得到约 200mg 粉末。取
1mg 粉末溶于 1ml 生理盐水,BCA 测得蛋白浓度为 。小鼠的急性毒性实验显
示 3 天和 14 天时 LD50 分别为 和 。亚急性毒性试验显示,高浓度 PAP-S
组血清 ALT 水平较阴性对照组轻度升高,但各组间BUN 水平无显著性差异。HE染色未
见明显病理变化。
结论: 成功制备了天然 PAP-S。低浓度 PAP-S 无明显肝肾毒性。
关键词:商陆种子抗病毒蛋白;急性毒性实验;亚急性毒性试验
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第二部分天然 PAP-S 体内抑制 HBV 复制的研究
目的:探讨天然 PAP-S 在 HBV 转基因小鼠模型体内抗 HBV 的效果。
方法:给药前,将 24 只 HBV 转基因小鼠按照血清 HBV DNA 和 HBsAg 水平配对,
分为阴性对照组、拉米夫定组、PAP-S 组。持续给药 45 天,
于给药第 15、30、45 天及停药 15 天后自眼眶静脉丛采血,荧光定量 PCR 法检测小鼠
血清中 HBV DNA 含量,ELISA 法检测血清 HBsAg 水平;取肝、肾组织,行 HE 染色
观察给药后小鼠肝、肾组织的病理变化,免疫组化染色计算肝脏 HBsAg 阳性细胞的数
量,real time RT-PCR 测肝组织中 HBV 复制中间体 mRNA 含量。
结果: 与生理盐水组相比,45 天时拉米夫定组、PAP-S 、
组对血清 HBV DNA 的抑制率分别为 %(P﹤)、%(P﹤)、%(P
﹤);对 HBsAg 的抑制率分别为 %(P﹤)、%(P﹤)、36%(P﹤
)。各组肝肾组织 HE 染色均未见明显病理变化。免疫组化染色显示 PAP-S 组小鼠
肝脏组织中 HBsAg 阳性细胞数量较生理盐水组减少。RT-PCR 结果显示天然 PAP-S 组
HBV mRNA 水平被抑制。
结论: 及 天然 PAP-S 在慢性乙肝病毒感染小鼠模型中对 HBV
DNA、HBsAg、HBV mRNA 有抑制作用。
关键词:商陆种子抗病毒蛋白;乙型肝炎病毒;HBV 转基因小鼠;抗病毒
第三部分全长及不同片段缺失型 PAP 基因及与 HBV 核心蛋白
融合原核表达质粒的构建及蛋白纯化
目的: 构建全长及不同片段缺失型 PAP 基因原核表达质粒及与 HBV 核心蛋白融
合的 PAP 原核表达质粒,并进行蛋白纯化。
方法:以 PGEM-PAP 质粒为模板设计引物,PCR 扩增得到全长及不同片段缺失型
PAP 基因,经酶切、连接后测序确认。以已测序的全长及不同片段缺失型 PAP 质粒及
HBc 质粒为模板设计引物,PCR 扩增 PAP-HBc 融合基因,与 PMD-18T 载体连接并转化,
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