文档介绍：中国医科大学
硕士学位论文
约氏疟原虫Pys48核酸疫苗的构建及免疫效应观察
姓名:孟红蕊
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:曹雅明
20090301
约氏疟原虫怂嵋呙绲墓菇ḿ懊庖咝в鄄目的·中文论著摘要·疟疾是疟原虫通过媒介昆虫蚊传播的人类最严重的寄生原虫感染性疾病。据因其死亡。尽管基于化疗药物为主的抗疟治疗对降低疟疾的病死率取得了显著成基于切断疟原虫在人与媒介昆虫蚊之间传播的传播阻断疫苗从而导致有性阶段疟原虫的进一步发育障碍,阻断疟原虫的传播途径。与疟疾感止耐药性原虫的扩散。更重要的是,从群体角度出发,个体接种疫苗后,受益的将是整个流行区内的人群。因此,有效的难兄瓶7⒈亟ù疵飨缘纳缁嵝特异性蛋白。鞍资潜泶镒优痹嬗行越锥闻渥犹搴团渥颖砻娴闹饕5鞍住近年来,在对恶性疟原虫甪流行区感染患者研究中发现,由于配子体携带者血清中存在具有传播阻断活性的抗砦豢体,其免疫血清在蚊膜喂养实验中能够明显降低配子体向蚊阶段发育的活性。基少于其他红前期和红内期候选抗原。同时研究发现哂邪腚装彼岜J匦懈患序列,高效价的抗体的应答依赖于蛋白表位空间构象的正确折叠。钚卤ǜ嫦允荆澜缭诘娜丝谏钤谂奔卜缦涨磕杲多万人效,但由于耐药原虫和杀虫剂性蚊的出现,单纯的化疗药物已经不能有效地遏制疟疾的流行。因此,开发新型有效抗疟疫苗成为目前疟疾防治亟待解决的重点课题。琓鸾ナ艿焦刈ⅰ脑硎且杂行越锥纬嫣逄匾毂泶锏表面靶蛋白作为抗原免疫人体,使之产生抗有性阶段虫体表面蛋白的特异性抗体,染阻断疫苗和发病阻断疫苗相比,其优点为:靶虫体明显少于红内期原虫数目;作为疫苗研制障碍的抗原变异少见;通过与药物或其它疟疾疫苗的联合应用可防益和经济效益。迄今,关于疟疾传播阻断疫苗候选抗原的研究主要集中于蚊阶段虫体表达的因克隆及测序结果显示,谛坌耘渥邮芫ü讨懈叨缺J兀蚨嗵悦飨
实验方法⒒蜃镈的提取及核酸疫苗的构建核酸疫苗的酶切鉴定⑹笛槎锩庖呒把G宀杉⒀G逄匾煨钥固寮觳确定疫苗的免疫活性是评价疫苗有效性的前提。核酸疫苗殖艱疫苗能够在宿主体内表达具有构象结构的抗原,诱发机体产生全面的免疫应答,其作为新型疫苗开发策略已广泛应用。目前核酸疫苗已经成功用于疟疾红内及红前期候选抗原的研究,以疟原虫红内及红前期表面抗原构建的核酸疫苗能够诱导宿主高水平的细胞和体液免疫。本研究通过构建约氏疟原虫畒酸疫苗,免疫实验动物小鼠,动态观察其免疫活性及传播阻断效应,旨在为有效抗疟疫苗的研制开发提供新的理论和实验依据。提取尸基因组琍扩增ɑ蛐蛄校ǜ闷尾迦肟,测序鉴定。回收并纯化双酶切产物亚克隆入真核表达载体.,转化大肠杆菌秆⊙粜钥寺 4罅坷┰鲅粜灾刈樽樱内毒素质粒提取试剂获得核酸质粒,此即为载有康幕虻暮怂嵋呙纭液体培养基培养阳性重组子过夜,少量提取核酸质粒,进行单、双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测。将溶于腄鼀又钟贐痗/⑹笞笥掖笸燃∪猓醮蚊庖吆和,以等量/酱渭忧棵庖撸看蝜肛弧M鄙柚每罩柿:,分离血清,.保存。以溶有配子体抗原篺的碳酸盐缓冲液包被孔酶标板,婀梗用含的獗訲缓冲液稀释免疫后不同时间的小鼠血清,椅路跤:∈偷腍标记的羊抗鼠固宸跤,加入底物溶液显色,酶标仪检澳处的值。核隆载体甌每
实验结果⒚庖哂〖:兔庖哂ü馐笛⒋úプ瓒闲в鄄⒛康幕虿迦肟寺≡靥寮安庑蚣核酸疫苗血清特异性抗体水平变化⑻,转移,ネ阎谭鄣腜封闭,与血清:稀释跤过夜。洗涤后,膜与昙堑难蚩故驣:餐跤吹雍驟显影观察。稀释梯度离心分离的配子体,涂布荧光片,冷丙酮固定。用含ネ脂奶粉的獗眨吹樱尤肟寡G稀释娣跤現昙的羊抗鼠G逯蟹从珼旧ǎ馄ü庀晕⒕倒鄄臁心脏采集感染后第煨∈,离心,去上清。加入含不同浓度免疫血清的动合子培养液,培养螅琍清洗两次,取和坑谟ü庠夭F希浔9潭āS煤%脱脂奶粉的℃封闭<尤肟购献佣献颖砻娴鞍譖:,清洗后加入标记的羊抗鼠ü舛梗跤,封片,测序结果显示插入的目的基因序列与蠵的预测序列相同,酶切鉴定显示目的条带与未笮∫恢隆于初次免疫后埽呙缑庖咦樾∈笱G逄匾煨钥固逅娇J汲鱿钟幸庖宓纳高。两次加强免疫后抗体一直维持于较高水平,尤其是末次免疫后,血清抗体效价高达,,怂嵋呙缬盏嫉男∈笱G蹇固迥芄惶匾煨允侗天然配子体抗原,免疫荧光分析发现特异性蛋白位于配子体表面。与对照组相比,怂嵋呙缬盏嫉奶匾煨钥寡G宥院献雍投献有纬删哂堋荧光显微镜计数合子和动合子的形成数量。
结论关键词成功构建怂嵋呙纾又諦痗鼠显示出良好的免疫原性,其免疫血清可显著抑制有性阶段原虫的进一步发育。明显的抑制作用,其中倍稀释抗血清的阻断作用较倍稀释的抗血清更为显著。疟原虫;怂嵋呙纾捍úプ瓒
·英文论著摘要·: