文档介绍：第二军医大学
博士学位论文
表皮细胞培养中维持干细胞特性相关技术的研究
姓名:程大胜
申请学位级别:博士
专业:外科学(烧伤)
指导教师:夏照帆;葛绳德

中文摘要表皮细胞培养中维持干细胞特性相关技术的研究室奎塑曼堕主堂垒兰盗实验一表皮干细胞检涓方法的建立方法。分离表皮细胞,通过不同粘附选择时间笙三兰堕查堂自年表皮细胞体外培养方法问世以来,表皮细胞培养技术及在皮肤组织工程中的实际应用取得较大发展。然而,体外培养获得的表皮细胞增殖能力不佳,限制了该技术的进一步实际应用。经体外培养所得到的细胞膜片中大部分细胞为终末分化细胞,己失去进一步增殖的能力。培养表皮细胞是否具有较强的分裂增殖能力,关键在于能否有效地保持表皮细胞群内干细胞的比例和生物学特性。因此如何保持表皮细胞较强的分裂增殖能力或者说干细胞特性,是能否在体外获得工程化皮肤的技术关键。干细胞一般是通过细胞表面标志分子进行识别,但还没有哪种标志分子能够单独用来区分表皮干细胞和短暂扩增细胞。虽然已经建立了细胞活力、生长曲线、克隆形成率等指标,但尚无公认实用的检测方法。本实验目的是利用流式细胞仪检测细胞膜蛋白整合素亚基和增殖细胞核抗原的荧光标记强度,建立简便易行的表皮干细胞检测方法。在建立表皮干细胞鉴定方法的基础上,以保持表皮细胞培养中干细胞的增殖潜能、控制其分化为目的,通过优化表皮细胞分离煌概ǘ取⑹奔、培养砥どひ蜃印⑶饣嫉厮伞⒁鹊核亍⒒袈叶舅的条件,以提高培养表皮细胞中的干细胞数量。并构建人整合素基因真核表达载体,用重组腺病毒转染表皮细胞,观察其生物学特征的改变。目的昧魇较赴羌觳釩蚉挠ü獗昙乔慷龋⒓虮阋行的表皮干细胞检测方法。富集表皮干细胞,观察细胞克隆形成率,流式细胞仪检测表皮细胞和、荧光免疫组织化学检测的荧光标记强度,分析上述指标间的相关性。结果掣窖≡可得细胞总数的ィ嘌天的克隆形成率为娃
∠赴以上,%,且克隆较小,数量多在以下,表皮细胞中疨扭胞的比例仅有.%,>喙胤治觯珻‘,可以作为表皮干细胞的检测指标。目的。通过优化表皮细胞分离条件,最大程度地获得基底层内的表皮细胞,并使所获的基底细胞中表皮干细胞的比例最大。方法捎肈酶与胰蛋白酶联合消化法分离培养表皮细胞。选择酶浓度、胰蛋白酶的浓度以及它们的作用时间作为鍪笛橐蛩兀用槐砩杓剖匝椋呕罴逊掷胩跫V饕?疾觳煌掷胩跫员砥细胞生长情况、贴壁率、克隆形成率、疨赴壤鹊挠跋臁U设计的计量资料数据用方差分析。结果酶、胰蛋白酶的作用浓度、作用时间对原代分离的活的表皮细胞数的无显著影响;胰蛋白酶的作用浓度、作用时间对诼实挠邢著影响;胰蛋白酶的作用时间显著影响了克隆形成率和干细胞比例。%,分离的原代表皮细胞中干细胞比例最高,克隆形成率也最高。。。分离的原代表皮细胞中千细胞比例最高,克隆形成率也最高,此时可以得到有克隆形成能力的细胞最多。实验三表皮细胞培养条件的优化%,阳性率为.%,谙赴壤.%;而粘附选择南赴博士学位论文第二军医大学中文摘要
时,霍乱毒素作用最好。在调查的浓度范围内,、/斗咖实验因素,每个因素设立雠ǘ人健@肔正交表设计试验,优化最实验四畃蛑刈橄俨《驹靥宓墓菇ḿ氨砥は赴H目的。探讨生长因子在人表皮细胞无血清培养中的作用,寻找较好组合,以期加快表皮细胞成皮时间,为临床应用提供理论依据。方法。分离人表皮细胞,选择⒁鹊核亍⒒袈叶舅亍⑶饣嫉乃个佳培养条件。主要考察不同培养条件对表皮细胞生长情况、克隆形成率、疨细胞比例等的影响。正交设计的计量资料数据用方差分析。结果谖扪G迮嘌卸耘嘌吮砥は赴纳ぜ霸鲋秤忻飨源俳用,差异非常显著;在一定浓度范围内~/,随ǘ忍岣撸в加强。浓度在/保鹊核刈饔米畲螅耘嘌赴纳ぜ霸鲋骋灿杏跋欤氢化考的松作用不明显。⒁鹊核亍⒒袈叶舅亍⑶饣嫉乃煞直鹑/浓度时对细胞生长及增殖产生最大影响。结论⒁鹊核亍⒒袈叶舅亍⑶饣嫉乃煞直鹑/、“痬ǘ仁保韵赴ぜ霸鲋巢畲笥跋欤诖颂跫拢表皮细胞的生长比较迅速,表皮细胞的分化不太明显,保持了较旺盛的增殖力。目的菇ê琁虻闹刈橄俨《驹靥澹H救嗽嘌砥は赴校观察基因表达对表皮细胞增殖及干细胞比例的影响,为进一步皮肤组织工程研究提供理论基础和研究手段。方法肁低彻菇ê,筛选、包装、扩增并纯化后,将其转染人原代培养表皮细胞,以非载体腺病毒转染做对照组。荧光显微镜下观察细胞被病毒感染后绿荧光表达情况变化,测定克隆形成率、疨细胞比例,两组间统计学分析采用非配对资