文档介绍：大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天: 1. 将适合菌株(如 XL1-Blue, DH5 α)置于 LB 或其他营养丰富的培养基上,在 37°C下过夜培养 ( 250-500ml )以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水(总量约 升),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天: -1ml 过夜培养物至装有 500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2 升挡板摇瓶中 °C下剧烈振荡培养 2-6 小时 值(培养 1小时后每半小时测定一次) 值达到 - 时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少 15 分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时) 8. 细胞在 4°C5000g 下离心 15 分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在 4°C的 10% 甘油中保存一两天) 。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的 2/3 体积。 10. 照上面步骤重复离心,小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心,弃上清液 13. 用20ml 灭菌的、冰冷后的 10% 甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散) 15. 用10% 甘油重悬浮细胞至最终体积为 2-3ml 16. 将细胞按 150 μl等份装入微量离心管,于-80 °C保存转化方法: 1-10 μlDNA ,冰上培育约 5分钟 1-3 μlDNA ,冰上培育约 5分钟 DNA/ 细胞混合物至冷却后的 2mm 电穿孔容器(无泡)中 P1000 ,准备好 300 μlLB或2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲( 200 欧姆,25μFd, 千伏)(检查时间常数, 应该在 3以上) 300 μl的LB或2xYT 至电穿孔容器中 °C下培养细胞 40分钟至 1小时以复原 【实验目的】 1、了解感受态细胞制备与转化的原理 2、掌握感受态细胞制备与转化的操作步骤 3、获得转化有质粒 pGEX-NS53 的转化菌株【实验原理】转化作用是在一定条件下,一种特定的 DNA 分子(供体或称转化因子)转入到一定的细菌体内(受体菌),使其发生遗传形状改变的过程。在正常生长条件下,少数细菌可发生转化作用,但大多数细菌并不发生转化, 只有在一定条件作用下(如用 Ca++ 处理细菌细胞或电刺激),细菌呈现感受状态后,外源 DNA 才能转化进入受菌体内。因此,若想将外源 DNA 分子转化进入一定的受菌体内,通常需将受体菌先制备成易感受状态。感受态通常指的是细菌具备吸收转化因子的一种生理状态。产生感受态细胞的理论机制目前除有一些假说外,并无统一的结论。一般说来,细菌细胞在对数生长的早中期,经处理后,有一定的转化能力,但在它们进入静止生长期以后, 就逐渐丧失。因此进行细菌细胞转化时,掌握合适的细菌培养时机是很重要的。本实验所用的供体 DNA 分子为一个重组质粒,它是将人庚型肝炎病毒(HGV )NS5 区的一段长度为 881bp 的cDNA 片段( NS53 )插入