文档介绍：PCR扩增失败的原因分析
2010-12-13 16:48:31|分类：默认分类|字号订阅
PCR扩增失败原因分析，PCR产物电泳
2010-05-15 16:07
模板质量问题：
）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的要选择单一型的高保真酶，如 Stratagene 的 Pfu， NEB 公司的 Vent DNA聚合酶， X10-5碱基/循环数；QIAGEN公司新推出的
ProofStart DNA 聚合酶，兼特异性与保真性于一体，其聚合酶及 Proofreading 活性都为热启动，可避免引物降解，错配率达2-4X10-6碱基/循环数，加上优化的反应体系，可在室温下配置反应液，可进行复杂模板（高GC含量、二级结构）及长片段的扩增，的确是这类酶中的佼佼者。
高耐热性 Taq 酶对于有些模板变性温度较高，需要时间较长的用户，可能要求高耐热性 Taq酶，这里介绍NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通Taq酶耐热性的三倍以上，前者在95°C 半衰期近7小时，100C近2小时；后者更甚，分别为23小时和8小时。
超长片段扩增Taq酶
对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到超长片段的扩增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶， Proofreading酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增10kb片段，简单模板可达 40kb。
关于复杂模板的扩增
对于模板结构复杂，如GC含量高（＞60%），有二级结构等，普通的Taq 酶可能难以延伸下去，加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行，但DMSO有毒，而且用量需要优化。QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液，操作方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。
关于条件的优化
现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液，如QIAGEN公司的缓冲体系，对温度和Mg2+的耐受性很强，随试剂盒有推荐的操作手册，大大减少了反应条件的优化，如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物，一次成功率极高。但任何东西都不是万能的，如果碰到比较特殊的情况，还需要仔细分析，优化调整。
以上就Taq酶的一些基本分类分别进行了介绍，具体选购时要根据实验需要择其重点，再参照其他参数，才能选到最合适的Taq酶。我们会及时将最新的技术和产品推荐给大家，希望能帮助大家更快更好的达到实验目的。
四、模板浓度过低。
五、 •退火温度过高。有可能，可以做个梯度PCR试一下。
六、循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够。这个可能性不大。
七、 dNTP 浓度
低时 PCR 产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100》l PCR液中含dNTP各40u mol/》g 的DNA （dNTP消耗一半），所以，你不小心多加了 4倍的量，会很影响PCR结果，即Taq酶活力要降低20〜30%,即底物抑制。
八、PCR产物电泳
电泳图不清晰,可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧。换新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试。
marker 都出问题说明是你的胶的问题,或者电泳操作的问题。
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循
环次数过多引起。
图：
其对策有：
减少酶量，或调换另一来源的酶。
减少dNTP的浓度。
适当降低Mg2+浓度。
增加模板量，减少循环次数。
如何获得亮的电泳条带
PCR反应前5个循环可以降低退火温度5°，后面30-35个循环恢复正常退火温度。也可以以第一次PCR的产物作为二次PCR的模板。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结
常
具
可能
处理办法
备1
见问题
体情况
的原因
注
菌培养不好或失败
抗性核对抗性，尽可能提供载体
不对或菌信息。
已死
或菌重新提供菌液，或提供2ug
培养条件纯化质粒。
特殊
样
质粒提不出
质粒客户自己采取大量提取的
拷贝数极方法提供2ug纯化质粒。
低或
培养
方式不当
品准备
问题
质粒产量很低
低拷客户自己采取大量提取的
贝数质粒方法提供2ug纯化质粒。或
培养
方式不当
自带质粒或已纯化PCR 产物量极低
是否质粒：电泳检测浓度大于
为电泳法100ng/ul，体积大于20ul。定量，
测 OD值法不可靠, 电泳检测
总量