文档介绍：PCR技术(十一):PCR片段拼接的SOE和SDL方法
PCR技术(多聚酶链式反应)是现代分子生物学的一个巨大突破,它能在体外迅速、大量、灵敏地扩增基因片段。可是,经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效拼接,却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点,这不但操作繁杂,而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因拼接的新方法,即SOE和SDL法,就能巧妙地解决这个问题。
SOE法
1989年,Horton等人提出了SOE法(Gene splicing by over lap extension),即通过复制时DNA链的交错延伸不实现基因拼接。本法可分四步进行。
(1)引物设计:引物a和d是常规引物;b的左半段为常规引物,右半段为基因Ⅱ的引物序列;c同理;则b和c的部分碱基可互补配对。
(2)基因I、Ⅱ分别扩增,产物相应为片段A、B和C、D。
(3)两种产物混合,经变性及退火处理,A链和D链部分碱基互补配对,成杂交链。
(4)在DNApolymeraseI作用下,A和D链互为引物和模板,合成出A'D'链,即为基因I 和基因Ⅱ的接接产物。若在引物中引入突变的碱基序列,则在接接产物中,将按预先设计要求出现定点突变。
SDL法
1991年下半年,Lebedenko等人提出SDL方法(Gene splicing by directed liga- tion),即直接拼接法,它在SOE法基础上又有新的突破。本法的要点如下:
(1)限制性内切酶,EcoRI核酸内切酶(或其它Ⅱs类限制性内切酶)能专一性识别 6bp的非回文序列,并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1—5个核苷酸,产生一个以突出的4个核苷酸为结尾的5'末端。因而该伸头末端与酶切位点序列无关, 而是由切点附近的序列决定的。
(2)扩增时实际运用的引物的构建。以exon5的实用引物为例:5'链引物包括常规5' 链引物序列和BamHI识别位点及起密码