文档介绍：PCR技术(十六):PCR产物测序
PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测序技术相结合后,它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质粒或病毒基因组相比,直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生物体(如细菌、病毒等)的体外系统,因而它更容易标准化(即例于自化2);对于每个待测样品,只需测定一个单链序列,因而它也就更快和更准确。相比之下,间接测序为了区别在PCR反应过程中由DNA聚合酶引入的随机错朽核苷酸所引起的原始基因组序列中的突变,以及由体外重组而产生的人工扩增产物,如产生镶嵌等位基因(混合克隆) 等,每个样品不得不测定几个PCR产物克隆的序列。
不需借助在细菌中克隆就可直接获得清蜥和准确的序列结果,其难易程度取决于:1)只扩增靶序列的PCR引物的扩增能力(通常称为PCR特异性);2用以获笪测序模板的方法。与引物物异性及模板制备有关的问题将在下面谈到。虽然DNA测序的化学法(Maxam-Gilbrt)可以用来直接测序,但我们这里仅讨论Sanger的末端终止法。
最佳的PCR条件
PCR反应的特异性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所决定的。对于特定的引物组,PCR的特异性可以由于采用最佳的反应条件、退火温度和PCR缓冲液中的 MgCl2浓度而发生明显的变化。,∽, 浓度,以选择最佳Mg++浓度。一个较常遇见的问题是,使PCR特异性达到最高的MgCl2 浓度导致PCR扩增失败(dropouts)。这可能是由于模板DNA溶液中有较高的EDTA,它隆低了提供给Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此,对于扩增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA, 。
PCR反应的温度范围包含有三个不同的恒定期:变性期、退火期和延伸期,还有它们之间的过渡期。为了获得用于序列分析的模板或杂交探针的单链DNA,通常并不需要改变参数。
凝胶纯化PCR扩增的靶序列
如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物,可采用新的寡核苷酸重新进行扩增,或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物,而后再各自重新扩增进行序列分析。长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离:
-100bp时,可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来分离。
。
∽100μlTE浸泡胶片,可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出来。
(1-5%)进行第二次扩增,为得到纯净单一的产物,用于第二次PCR扩增的凝胶抽提物的量必须少于1ng。
。因而,如需重新扩增供Tab聚合酶测序用的片段,最好用丙烯酰胺电泳分离。
当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时,如来自几个新近复制的基因,或重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子,可以通过下列两种不同方法