文档介绍：PCR技术(二):PCR反应模板的制备
PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计,,在前二者都稳定可行的情况下,,决定分离模板核酸(DNA或RNA)(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子,提高模板核酸的产量.
传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份,溶解细胞膜, 使蛋白质变性,再用蛋白酶K来消化去除蛋白质,尤其是与DNA结合的蛋白质,再用酚:氯仿抽提,然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸,,视PCR实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定.
模板核酸的提取制备方法
(一)蛋白酶K消化裂解法:适用于所有标本的消化处理,(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌物、尿,粪便等.

①蛋白酶K消化液:10mmol/L ()
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
%SDS
100~200ug/ml蛋白酶K.
②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,临用时加入消化液中.
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有些标本、在用蛋白酶K消化前,还需预处理一下,如粪便、分泌物、痰液、组织块、石蜡包埋组织等,其方法有离心去掉杂质,脱蜡等.
临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50~,55℃1~3小时, 或37℃~2次,再加等体积的氯仿:异戊醇(49:1)抽提一次,上清加入1/,(或加等体积的异丙醇)-20℃,沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1~2次,特别小心的吸弃或倒掉上清,真空或37℃温箱或室温干燥,,取3~8ul 用于PCR扩增,或放-20℃保存.
蛋白酶K消化法除上述经典处理法外,亦可在蛋白K消化处理标本,经离心处理后,吸取上清经95~97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后,直接作核酸模板用于PCR扩增. 如杂质较多,还可经酚:氯仿抽提后,,Taq酶活性不受影响,,技术要求高.
(二)直接裂解法:标本(组织细胞,分泌物)加PBS或生理盐水离心洗涤后,加消化裂解液20~50ul(%NP-%吐温-20),95~98℃,15~30min以裂解病原体, ~10min,取上清20~,%的NP-%2-ME做裂解液,95℃30min消化处理,离心取上清,PCR扩增检测HBV DNA.
(三)碱变性法:取血清20ul,加入1mol/L NaOH