文档介绍：PCR技术(十七):用PCR扩增cDNA库中的特异序列
最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库,然后用抗体或 DNA探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因,,而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋白质序列结构的资料。聚合酶链的反应(PCR)方法可使一种特异DNA扩增几百万倍, 并已成为分子克隆和诊断的十分有用的工具。最近,TAQDNA聚合酶的使用极大地简化了PCR方法。该酶在75℃左右有很宽的最适温度区,在小于95℃以下重复保温仍能存活,更重要的是,该酶活性高,无外切酶活性,。下面我们将描述在鉴定南美蝙蝠唾液腺外分泌蛋白中使用的方法和过程。
(MSDRL,WestPoint,PA)纯化了从南美蝙蝠唾液腺中分离的一种外分泌蛋白,因此其部分肽序列(GlyLeuGlyCysAspLeuMet)是开始本实验的关键。为检验不用传统筛选方法即能克隆该蛋白基因的假说,我们采取了如下策略:
a).在Lambdagt22中建立一个在蝙蝠唾液腺中所有转录子的cDNA库,并在边侧加上SP6、T6聚合酶启动子,这样可以直接用两种启动子序列之一作引物进行扩增和测序。
b).合成四组引物,组合起来代表已知的部分蛋白序列的全部有效密码子组合(1024种衍生列)。C).这些引物与适当的T7或SP6聚合酶序列引物组合成对,以总cDNA 库作模板,进行PCR扩增。所得到PCR产物应该代表编码该蛋白的部分cDNA。对这些 PCR产物直接测序应能得到足的序列信息以合成同源引物,进一步进行PCR扩增,产生的DNA片段结合起来可给出编码该蛋白的cDNA的完整序列。
直接用2%琼脂糖凝胶分析PCR产物,组混合引物[引物1:5'(CT)TXGG(ACGT)TG(CT) GA (CT)(CT)TXATG3',。每组混合引物产生约450bp和550bp的两个产物。用Wong等所述的方法进行凝胶纯化和测序该PCR的主要产物450bp带。混合引物产生清蜥可读的序列(约200个核苷酸),虽然可有256种引物组人合(简并度)。在这个序列信息的基础上,合成另两组引物[引物Ⅱ(正向)]分别与SP6或T7聚合酶序列引物配对,按前面所述进行PCR扩增,引物Ⅱ/SP6和引物Ⅲ/T7分别产生270bp和420bp片段,测定这两个片段序列,与最初得到的DNA片段结合来,得到一个467bp编码序列。该cDNA(270BP+420 bp)的多余序列为200bp的PolyA尾序。
PCR策略
(A)n、(C)n、(G)n、(T)N:同聚物序列SP6,T7:SP6和T7聚合酶启动子,分别构建入Lambdagt载体。。PCR在总体积100μl,含50mMKCL、 10mMTris,,,%明胶,200μM每种dNTP,, 150ng噬菌体库模板DNA,50ng()每种引物的体系中进行。程序如下:初始模板变性94℃,8分钟;之后为94℃2分种,60℃3分种,30个循环。PCR反应产物用氯仿抽提以除运送