文档介绍：PCR技术(十):PCR产物克隆方法
平端连接
通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基,使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高,。在采用大量T4DNA连接酶并配以5—10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物,用PUS19 的HincⅡ位点进行克隆,以X-gal和IPTG筛选,常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA,然后再用平端连接法克隆PCR产物。 
粘端连接
引物中设计入限制酶位点:由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基,因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端,即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高,且当两引物中设计不同酶切位点时,可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长 PCR引物,除限制酶识别序列外,还需要在其5'端多合成3—4个碱基以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此,其酶切效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变 PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序列的互补性是PCR成功的关键,在PCR引物的中部或近5'端改变1个或几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的长度,而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆,此方法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆,似乎5'加端法更为适宜。
T4DNA聚合回切产生粘端
如PCR两引物的5'末端是A或T,则可在其5'GG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP 存在的情况下,用T4DNA聚合酶进行处理,则T4DNA聚合酶因具有3'→ 5'外切酶活性而消去3'末端的G和C,I和XmaI粘性末端(图1)。 I和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需在PCR引物的5'端加2—4个碱基,但其可选择的限制酶类有限。
T-vector法
TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱基,所加碱基几乎全是腺苷。据此,Marchuk等人采用3'端突出一个胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物,其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端,然后在2mmol/LdTTP 存在下,用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸苷。因为在4种dNTP都存在时,Taq聚合酶选择性参入dATP,而当仅一种dNTP存在时,它只能参入该种碱基。因此,在只加入ddTTP时, 用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾载体,称为T-vector。用这种T-vectorsk可以较有效地直接克隆 PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T-vector的方法。他们使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3'