文档介绍：实验二基因的PCR扩增技术
生工1201班 122303121 汪文斌
一、实验目的
1、学****PCR反应的基本原理与实验技术
2、从BCG基因组DNA中PCR扩增Rv1791(PE19)基因
二、基本原理
1、PCR类似于DNA的天然复制过程。
2、将待扩增的DN***段与其两侧互补的两段寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增倍数可达2n倍。
3、DNA的变性和复性
1)加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。
2)解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。
三、实验材料

?PCR反应缓冲液、4?dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物(P1、P2)、超纯水SW
、移液器、 PCR仪、离心机
四、实验步骤

Rv1791-F: ATGAATTCAGGAAGACAGCATGTCGTTC(EcoR
I)
Rv1791-R: TTCAG(XhoI)
(二)准备PCR反应溶液
10×PCR反应缓冲液
4×dNTPs
引物P1 1μl(10nM)
引物P2 1μl
模板DNA 2μl
Taq DNA聚合酶
用无菌去离子水至 25μl
↓
用手指轻弹PCR反应管管底部,使溶液混匀
↓
在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底
(三)PCR扩增反应
在PCR仪中设计如下反应程序:94?C、5min;94?C、30sec,61?C、
40sec,72?C、30sec,30个循环;72?C、将已混匀
的PCR反应管置于PCR 进行
反应。反应完毕,将样品取出置于冰浴中待用
(四)结果检测
本PCR扩增的产物DN***段长度为300bp,%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。从每个反应管中取5ul PCR产物进行电泳检测。
五、实验结果与分析
本组实验序号为11号。
Rv1791(PE19)基因的分子量在250bp-500bp之间,符合已知数据DNA分子量是300bp,PCR扩增成功。本组实验PCR扩增的DNA量同其他组相比明显较少,分析可能的原因有实验一时提取的DNA不纯,含量较少,DNA未与PCR反应溶液混合均匀,实验材料4 dNTPs不足未按要求添加。
六、思考题
分析影响PCR结果的因素。
解: :
不同PCR仪品牌与型号在温度控制性能上的不同直接影响了三种温度平台的温度的准确性和不均一性,因而影响了整个PCR反应的实验结果。另外,升温速度的不同,温度下降梯度的不均一性,温度过低,温度过冲,也是重要的因素。最差的情况,一个本该阳性的结果却可能得出阴性的结果。对于实时PCR,荧光信号输出和产量/溶解曲线,直接与温度控制有关系,而这些结果很可能是戏剧性的。 :
没有任何两台PCR仪器的温度控制是一模一