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专利名称::含有来自人类脂肪组织的多塑性干细胞、成纤维细胞和脂肪或脂肪细胞的整容或整形组合物的制作方法
技术领域:
:本发明涉及一种用于整容或整形外科手术的组合物及其制备方法,所述组合物含有来自人类脂肪组织的***干细胞、成纤维细胞以及脂肪或脂肪细胞(Adiopocyte)。
背景技术:
:干细胞指的是既具有自我复制能力又具有分化成至少两种细胞能力的细胞,其可被分为全能干细胞(totipotentstemcell)、多能干细胞(pluripotentstemcells)以及多塑性干细胞(multipotentstemcells)。近来,发现脂肪组织是新的多塑性干细胞源(Cousin等人,SBiC.,301:1016,2003;Miranville等人,C/腳/a"临110:349,2004;Gronthos等人,/Ce〃尸—W.,189:54,2001;Seo等人,朋iC.,328:258,2005)。也就是说,报道了通过抽脂术得到的人类脂肪组织含有一组未分化的细胞,它们具有分化成脂肪形成细胞、成骨细胞、肌源细胞和成软骨细胞的能力(Zuk等人,7!wwe7:211,2001;Rodriguez等人,5SiC.,315:255,2004)。而且通过动物模型实验己经知道,来自脂肪组织的细胞具有再生肌肉和刺激分化成神经血管的能力。由于这种脂肪组织具有的优点在于其可以被大规模提取,其作为克服现有缺点的新的干细胞源已经引起瞩目。到目前为止,己知的来自脂肪组织的干细胞包括能够分化成上皮细胞的人类脂肪来源的
***干细胞(Brzoska等人,SSWC,330:142,2005),能够分化成成骨细胞和脂肪形成细胞的人类脂肪来源的***千细胞(Cao等人,5SiC,332:370,2005),能够分化成神经细胞的人类脂肪来源的***干细胞(Safford等人,SR/C,294:371,2002),能够分化成脂肪形成细胞的鼠脂肪来源的干细胞(Ogawa等人,5BiC,319:511,2004),能够分化成成骨细胞和成软骨细胞的鼠脂肪来源的干细胞(Ogawa等人,SSiC,313:871,2004),能够分化成成软骨细胞的人类脂肪来源的干细胞(Awad等人,BZoma化n'a/s,25:3211,2004),能够分化成神经细胞的鼠脂肪来源的干细胞(Fujimura等人,B万iC,333:116,2005),和能够分化成成骨细胞、成软骨细胞和神经细胞或者肌肉细胞的脂肪来源的干细胞(美国专利6,777,231)。虽然到目前为止已经付出了许多努力将脂肪来源的干细胞用于医学领域包括治疗不可治愈性的疾病,但较少努力去尝试使用干细胞进行整容和整形外科手术。因此,本发明的发明人付出了极大的努力在整容和整形外科手术领域(包括皱纹改善、松弛皮肤的保护及类似问题)中使用干细胞,通过培养通过抽脂术得到的含有脂肪细胞的悬浮液,收集含有***干细胞和成纤维细胞的细胞层,并将它们与脂肪细胞混合来进行实验,并发现得到的组合物对于整容治疗和整形外科手术是有用的,从而完成了本发明。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于整容或者整形外科手术的组合物及其制备方法,所述组合物含有来自人类脂肪组织的***干细胞、成纤维细胞和脂肪或脂肪细胞。为了实现上述目的,本发明提供一种制备用于整容或整形外科手术的组合物的方法,所述组合物含有(i)来自人类脂肪组织的***干细胞,(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞,所述方法包括下列步骤(a)在培养瓶中培养通过抽脂术从人类脂肪组织得到的含有脂肪的悬浮液以收集含有来自脂肪的附着在培养瓶上的***干细胞和成纤维细胞的细胞层;以及(b)将含有来自脂肪的***干细胞和成纤维细胞的收集细4胞层与脂肪或者脂肪细胞混合。本发明还提供一种制备用于整容或整形外科手术的组合物的方法,所述组合物含有(i)来自人类脂肪组织的***干细胞,(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞,所述方法包括下列步骤(a)通过在含有N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的培养基中培养人类脂肪组织来源的微粒制备来自脂肪的***干细胞,以收集来自脂肪的干细胞和成纤维细胞;以及(b)将所选来自脂肪的***干细胞和成纤维细胞与脂肪或者脂肪细胞混合。此外,本发明提供一种用于整容或整形外科手术的组合物,所述组合物含有
(i)来自人类脂肪组织的***干细胞,(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞。通过下列详细描述和所附的权利要求书,本发明的其他特征和实施方式将更加清楚。图1显示了附着在培养瓶上的细胞的图片,其中含有根据本发明的来自人类脂肪组织的多塑性干细胞、成纤维细胞以及类似物(原始放大倍数100x)。图2示出了使用免疫染色在含有CORM-2的MEBM培养基中球形培养的(sphere-cultured)来自人类脂肪组织的多塑性干细胞中Nestin、Oct4、SH2、SH3/4的表达结果(原始放大倍数100x)。图3显示了由根据本发明的来自人类脂肪组织的多塑性干细胞分化成的脂肪细胞的图片(A:分化状态的相差;和B:使用油红O染色法染色的脂肪细胞,原始放大倍数200x)。具体实施例方式在一个方面,本发明涉及一种用于整容或整形外科手术的组合物,其含有来自人类脂肪组织的干细胞、成纤维细胞和脂肪或脂肪细胞。根据本发明的组合物优选可被用于通过形成新的乳房组织的乳房增大或者铍纹去除,但不局限于这种目的。例如,其可通过微量脂注射和自体脂肪移植用于保持面部皮肤的紧致以及去除眉间的皱眉线和鼻唇沟的。理想的是在根据本发明的组合物中含有的来自人类脂肪组织的***干细胞是自体来源细胞。根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物可通过培养通过抽脂术得到的来自人类脂肪组织的含有脂肪的悬浮液,并将得到的来自脂肪组织的***干细胞和成纤维细胞与其他细胞或组织混合来制备。在一种实施方式中,根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物可通
过下列步骤制备(a)在培养瓶中培养通过抽脂术从人类脂肪组织得到的含有脂肪的悬浮液以收集含有来自脂肪的附着在培养瓶上的***干细胞和成纤维细胞的细胞层;以及(b)将含有来自脂肪的***干细胞和成纤维细胞的收集细胞层与脂肪或者脂肪细胞混合。具体地,所述组合物通过下列方式制备培养通过抽脂术得到的悬浮在生理盐水中的含有脂肪的悬浮液,并在洗涤附着在培养容器诸如培养瓶中的干细胞和成纤维细胞之后收集,在收集它们之前,使用生理盐水将它们洗涤1次以便除去上清液中残余的脂肪和血细胞,并胰蛋白酶化包括附着在底部的干细胞和成纤维细胞的细胞层,通过刮下细胞层直接收集被悬浮在少量生理盐水中的细胞,或者通过离心收集离心的细胞,接着将收集的细胞与脂肪混合。在本发明中,***干细胞优选为来自中胚层的细胞,来自中胚层的细胞优选为脂肪形成细胞。在本发明中,***干细胞优选在含有地塞米松、消炎痛、胰岛素和IBMX的a-MEM培养基中培养以分化成脂肪形成细胞。在另一种实施方式中,根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物可通过下列步骤制备(a)通过在含有N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的培养基中培养人类脂肪组织来源的微粒制备来自脂肪的***干细胞,以收集来自脂肪的干细胞和成纤维细胞;以及
(b)将所选来自脂肪的***干细胞和成纤维细胞与脂肪或者脂肪细胞混合。抽脂术作为用于脂肪去除的整容或整形外科手术的技术,指的是通过真空泵或者真空注射器经由供体区域中的切口抽取脂肪。在本发明中,对于脂肪或脂肪细胞来说,可以使用通过抽脂术附带从人类脂肪组织中获得的脂肪或脂肪细胞,但并不限于此。在本发明中,脂肪包括脂肪组织。当脂肪被用作用于根据本发明的整容或整形外科手术的组合物时,优选每lml脂肪组织含有1>tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11结果,如表1中所示,根据本发明的来自脂肪的***干细胞显示对CD73的91%、对CD卯的97%,对CD29的96%,对CD44的83%,以及对CD105的80%阳性应答。而且,对其他抗原的FACS分析的结果表明,本发明的干细胞显示对所有CD33,CD34,CD45,CD4,CD31,CD62p,CD14和HLA-DR的阴性免疫应答。实施例3:来自脂肪组织的干细胞的免疫染色分析将在实施例1中得到的来自脂肪组织的干细胞用PBS洗涤3次并用含有4%多聚甲醛的PBS固定30分钟。%Triton-X100渗透10分钟。在使用PBS洗涤3次后,将细胞用10%NGS培养1小时,然后用含有初级抗体的PBS培养过夜。将细胞再用PBS洗涤3次,并允许其在暗室中与第二抗体反应1小时。在用PBS洗涤3次之后,将细胞固定(mounted)。结果,如图2所示,根据本发明的多塑性干细胞球体显示了对所有可被认为是未分化细胞的标记物的
Oct4和作为间叶细胞干细胞的标记物的SH2(CD105)和SH3/4(CD73)的阳性应答。实施例4:来自脂肪的多塑性干细胞分化成脂肪细胞将在实施例1中得到的来自脂肪组织的多塑性***干细胞在含有5%FBS,lpM地塞米松,200jxM消炎痛,lOpg/(3-异丁基-l-***黄嘌呤)的a-MEM培养基中培养两周,诱导脂肪形成分化,然后使用油红O染色法进行分析。结果,如图3所示,发现来自人类脂肪组织的多塑性干细胞分化成脂肪形成细胞。实施例5:使用来自脂肪的多塑性干细胞的动物分析使用老鼠检测由来自脂肪的干细胞保持脂肪组织量的能力。使用12只老鼠作为对照组,12只老鼠作为实验组。在实验组中将脂肪(11111)+来自脂肪组织的多塑性干细胞和成纤维细胞(5x105/200pl盐)注射到头部真11皮中,老鼠中不存在皮下脂肪组织,而将脂肪(lml)+赋形剂(20(^1盐)注射到对照组中。注射15天后,通过鼠的头部切口分离脂肪组织,并测定脂肪组织的量。结果,在对照组中注射的脂肪量减少了31%,而在其中注射了通过实施例1制备的组合物的实验组中注射的脂肪量的45%得到保持。通过该结果发现,根据本发明的来自脂肪组织的干细胞和成纤维细胞具有减少由抽脂术产生的脂肪量降低的效果。工业实用性如上详细描述的那样,本发明具有提供一种用于整容或者整形外科手术的组合物的效果,所述组合物含有来自人类脂肪组织的***干细胞、成纤维细胞和脂肪或者脂肪细胞。根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物不仅对于整容目的来说是有用的,诸如提高皮肤的紧致度,改善铍纹及松弛的皮肤,以及恢复通过整形外科手术降低的区域,而且对于新的乳房组织的形成也是有用的,因为来自人类脂肪组织的***干细胞可分化成脂肪细胞。虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述,对本领域技术人员来说显而易见的是,该描述仅仅用于优选实施方式,而不是限制本发明的范围。因此,本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其
等同物来限定。权利要求1、一种用于整容或整形外科手术的组合物,其含有(i)来自人类脂肪组织的***干细胞,(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞。2、根据权利要求l所述的组合物,其特征在于,组合物用于新的乳房组织的形成或者铍纹去除。3、一种制备用于整容或整形外科手术的组合物的方法,所述组合物含有(i)来自人类脂肪组织的***干细胞,(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞,所述方法包括下列步骤(a)在培养瓶中培养通过抽脂术从人类脂肪组织得到的含有脂肪的悬浮液以收集含有来自脂肪的附着在培养瓶上的***干细胞和成纤维细胞的细胞层;以及(b)将含有来自脂肪的***干细胞和成纤维细胞的收集细胞层与脂肪或者脂肪细胞混合。4、根据权利要求3所述的方法,其特征在于,***干细胞是来自中胚层的细胞。
5、根据权利要求3所述的方法,其特征在于,来自脂肪的***干细胞在含有地塞米松、消炎痛、胰岛素和IBMX的(x-MEM培养基中培养。6、一种制备用于整容或整形外科手术的组合物的方法,所述组合物含有(i)来自人类脂肪组织的***干细胞,(ii)成纤维细胞以及(m)脂肪或者脂肪细胞,所述方法包括下列步骤(a)通过在含有N-乙酰-L-半胱氨酸的培养基中培养人类脂肪组织来源的微粒制备来自脂肪的***干细胞,然后收集来自脂肪的干细胞和成纤维细胞;以及(b)将收集的来自脂肪的***干细胞和成纤维细胞与脂肪或者脂肪细胞混合。全文摘要本发明涉及一种用于整容或整形外科手术的组合物及其制备方法,所述组合物含有来自人类脂肪组织的***干细胞、成纤维细胞以及脂肪或脂肪细胞。根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物可通过下列方法制备培养通过抽脂术得到的含有脂肪的悬浮液,然后收集含有附着在培养瓶表面上的来自脂肪的***干细胞和成纤维细胞两者的细胞层,接着将脂肪细胞加入到收集的细胞层中。根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物对于整容目的来说是有用的,诸如皮肤紧密度的提高,皱纹及松弛皮肤的改善,以及由整形外科手术降低的区域的恢复,而且对于新的乳房组织的形成也是有用的。