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专利名称:用于筛选c-Fms激酶抑制剂的细胞模型及筛选方法
技术领域:
本发明属于细胞生物学和药学领域,涉及用于筛选C-Fms激酶抑制剂的细胞模型及筛选方法。
背景技术:
药物筛选模型是药物研发必不可少的药物活性研究平台。高内涵分析或高内涵筛选(HighContentScreening,HCS)HCS是ー种应用高通量荧光/明场显微成像和定量图像分析的自动化平台,整合开放式试剂与荧光标技术,在保持细胞结构和功能完整性的前提下,同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响,在单一实验中获取大量相关信息,确定其生物活性和潜在韋性。在闻内涵技术的基础上,建立激酶抑制剂的细胞筛选模型,结合高通量筛选技术,是创新药物筛选研究的必然趋势。以激酶作为药物(例如抗肿瘤药物)靶标在国际上已成为新药研发的热点。巨噬细胞集落刺激因子受体激酶(c-Fms,CSF-1R)是原癌基因c-fms的编码产物,与干细胞生长因子受体(c-Kit)、血小板衍生生长因子受体(H)GFR)、FMS样酪氨酸激酶3(Flt-3)等同属于III型酪氨酸激酶家族。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,CSF-1)与c-Fms结合后,激活其酪氨酸激酶活性,促进单核巨噬细胞系的存活、増殖和分化
(SherrCJ,RousselMF,-stimulatingfactor-lreceptor、c_fmsノ[J]·JCellBiochem,1988,38(3):179-187)。C-fms基因重复复制、突变、染色体易位以及M-CSF的过量表达等因素均能异常增强c-Fms激酶活性,使单核/巨噬细胞异常増殖或相关炎性因子的大量表达,最終导致造血系统紊乱、恶性肿瘤、炎症及动脉粥样硬化等疾病的发生。C-Fms抑制剂能够抑制受体激酶的磷酸化,阻断受体介导的细胞信号通路,是治疗C-Fms相关疾病的潜在药物(DouglassTG,DriggersL,ZhangJG,-stimulatingiactornotjustformacrophagesanymore!Agatewayintocomplexbiologies[J].IntImmunopharmacol,2008,8(10):1354-1376)。信号转导子和转录激活子(STATl)是c-Fms激酶细胞信号下游的重要分子,被c-Fms激活后进入细胞核,激活相关&因的转录(-1andcellcyclecontrolinmacrophages[J].MolReprodDev,1997,46(I):19-23)。STATl核转位程度,直接反映了c-Fms的激酶活性。据目前文献报道,筛选C-Fms抑制剂的方法主要有分子水平激酶活性測定法和细胞水平激酶磷酸化的免疫印迹检测法,但存在操步骤繁琐、定量化程度低等缺点。此外,由于c-Fms等受体激酶的磷酸化为短时间发生的过程,很难精确检測,以及在体外容易发生ニ聚化等原因,迄今尚未有基于高内涵分析、高通量筛选
c-Fms抑制剂的细胞模型的报道。
发明内容
本发明人通过创造性的劳动和大量的试验,建立了一种细胞模型,并且发现,通过对该细胞内的STATl核转位的分析,能够实现对c-Fms激酶抑制剂的筛选。由此提供了下述发明本发明的ー个方面涉及ー种细胞,其同时表达巨噬细胞集落刺激因子受体和STATl蛋白。根据本发明任一项所述的细胞,其满足如下的(1)-(3)—项或者多项(I)所述巨噬细胞集落刺激因子受体为人源的;具体地,为C-Fms;(2)所述STATl蛋白连接有可检测的标记;具体地,所述可检测的标记为报告基因;更具体地,所述报告基因为绿色荧光蛋白(GFP);(3)所述细胞为体外培养的哺乳动物细胞;优选人骨肉瘤细胞(例如人骨肉瘤细胞U20S)。本发明的细胞可以用于筛选酪氨酸激酶抑制剂或者评价化合物或组合物对酪氨酸激酶抑制活性,即作为筛选酪氨酸激酶抑制剂或者评价化合物或组合物对酪氨酸激酶抑制活性的细胞模型。其中,具体地,所述酪氨酸激酶为巨噬细胞集落刺激因子受体激酶,更·具体地,为c-Fms。本发明的实施例4中证明了该细胞模型的可靠性。在该细胞模型中,受体激酶介导细胞信号下游蛋白分子的核转位程度可反映c-Fms激酶的活性。将该模型用于酪氨酸激酶抑制剂的筛选,通过检测下游蛋白分子核转位的程度来评价化合物抑制
c-Fms激酶的活性。所述细胞可以通过如下步骤制备I)构建含有人巨噬细胞集落刺激因子受体基因的真核表达载体;2)将载体转染稳定表达STATl蛋白(例如GFP-STAT1融合蛋白)的人骨肉瘤细胞;3)筛选稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子受体和STATl蛋白(例如GFP-STAT1融合蛋白)的细胞系。本发明的细胞也可以通过将含人巨噬细胞集落刺激因子受体基因例如(c-Fms)的载体与含STATl基因(例如GFP-STAT1基因)的载体共转染空的人骨肉瘤细胞制得。本发明的另一方面涉及ー种细胞株(人骨肉瘤细胞株,U20S-GFP-STAT1/CFS-IR),,保藏日期2011年3月22日,保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该细胞株为能够稳定表达C-Fms和GFP-STAT1融合蛋白的人骨肉瘤细胞U20S。本发明的还一方面涉及ー种筛选C-Fms酪氨酸激酶抑制剂或者评估化合物或组合物对酪氨酸激酶的抑制活性的方法,包括使用本发明任一项所述的细胞或者本发明的细胞株的步骤。根据本发明任一项所述的筛选C-Fms酪氨酸激酶抑制剂或者评估化合物或组合物对酪氨酸激酶的抑制活性的方法,包括下述步骤用化合物处理细胞至少I小时后,再用巨噬细胞集落刺激因子激活巨噬细胞集落刺激因子受体激酶,检测并分析STATl发生核转位的程度,评估化合物对酪氨酸激酶的抑制活性。根据本发明任一项所述的筛选C-Fms酪氨酸激酶抑制剂的方法,包括下述步骤
I)将本发明任一项所述的细胞或者本发明的细胞株接种并进行培养;2)弃培养基,并用无血清的培养基进行清洗细胞至少I次;
3)加入待测化合物或组合物,在无血清的培养基中培养;4)加入含有巨噬细胞集落刺激因子并在无血清培养基中继续培养;5)分析STATl蛋白的核转位程度,评价化合物或组合物的活性。根据本发明任一项所述的筛选C-Fms酪氨酸激酶抑制剂的方法,其中,加入巨噬细胞集落刺激因子后的培养时间为5-35分钟;优选地,为20-35分钟,例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、或35分钟;更优选地,为30分钟。根据本发明任一项所述的筛选C-Fms酪氨酸激酶抑制剂的方法,其中,使用巨噬细胞集落刺激因子时,其终浓度范围为30ng/mL-1000ng/mL,优选100_600ng/mL,更优选为150-250ng/mL,特别优选的是200ng/mL。根据本发明任一项所述的筛选c-Fms酪氨酸激酶抑制剂的方法,其满足如下的
(1)-(5)中的一项或者多项(I)步骤I)中所述接种的细胞密度按照96孔板计为6-12XIO4个/mL,培养时间为12-48小时;优选24小时;(2)步骤I)、3)、或4)中的培养条件为37°C>5%C02、80%湿度;(3)步骤2)、3)、或4)%BSA和IOmMHEPES;(4)步骤3)-;优选I
小时;(5)步骤5)中分析STATl蛋白的核转位程度之前,包括如下的预处理步骤用PBS稀释的甲醛溶液固定细胞,室温避光放置20分钟,弃液,加入含有细胞核染料hoechst33342的PBS,室温避光放置30分钟。上述筛选c-Fms酪氨酸激酶抑制剂的方法亦可作为评价化合物或者组合物对酪氨酸激酶抑制活性的方法。本发明的还一方面涉及本发明任一项所述的细胞或者本发明的细胞株在筛选c-Fms酪氨酸激酶抑制剂或者在评价化合物或组合物对c-Fms酪氨酸激酶抑制活性中的用途。在本发明中,STATl和c-Fms可以參考GenBank登录号分别为BC002704和NM005211的序列,其核苷酸序列分别如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示。但是,在本发明中,STATl和c-Fms的序列并不局限于SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的序列,对SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列进行ー个或者多个取代、替换、缺失的具有STATl或c-Fms功能的序列也在本发明的保护范围之内。本发明还包括与SEQIDNO:1或SEQIDN0:2所不的序列具有大于70%、大于80%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、或大于99%的具有STATl或c-Fms功能的序列。在本发明中,具体地,所述酪氨酸激酶可以是C-Fms酪氨酸激酶。发明的有益效果本发明建立的细胞模型灵敏、高效、可靠,能够用于C-Fms酪氨酸激酶抑制剂的高通量筛选和/或高内涵筛选。本发明所建立的筛选方法比免疫印迹法灵敏度高,并且操作简单快速。
图I:hrM_CSF诱导表达人c_Fms的细胞内GFP-STAT1发生核转位现象。图2hrM-CSF诱导GFP-STATI发生核转位的剂量效应关系。η=6,±。图3hrM-CSF诱导GFP-STAT1发生核转位的药物筛选体系可靠性分析。η=6,平均"。图4hrM-CSF处理细胞的时间对GFP-STATI核转位的影响。图5U20S-GFP-STATI/CSF-1R细胞接种密度对GFP-STAT1核转位的影响。
图6hrM-CSF诱导GFP-STAT1发生核转位细胞模型中c_Fms抑制剂GW2580对核转位的抑制效果图(n=3;±)。图7hrM-CSF诱导GFP-STAT1发生核转位细胞模型中酪氨酸激酶抑制剂Sutent对核转位的抑制效果图(n=3;±)。图8:hrM-CSF诱导GFP-STATI发生核转位细胞模型中酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(Imatinib)对核转位的抑制效果图(n=3;±)。关于生物材料保藏的说明本发明涉及以下生物材料人骨肉瘤细胞株(U20S-GFP-STAT1/CFS-1R),其于2011-03-22保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号,中国科学院微生物研究所,100101。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件
(,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。主要药品与试剂质粒小量提取试剂盒购自OmegaBio_tek公司;限制性内切酶,T4连接酶购自TaKaRa公司;脂质体2000,hoechst33342染料购自Invitrogen公司;DMEM(Highglucose)购自Gibco公司;胎牛血清购自天津川页生化制品有限公司;新霉素(G418),嘌呤霉素购自Merck公司;hrM_CSF因子购自Peprotech公司;BSA,HEPES购自Amresco公司;所用到的激酶抑制剂均由本课题组合成;其他试剂均为国产分析纯试剂。主要仪器InCellAnalyzer1000或者InCellAnalyzer2000GEhealthcarelifescience细胞系U20S-GFP_STAT1人骨肉瘤细胞系Thermo(BioImage)实施例I:稳定表汰人c-Fms和STATl的细胞系的津立构建含有人C-Fms全长cDNA(由美国圣犹大儿童研究医院CharlesSherr博士和MartineRoussel博士惠赠)的pC0R0N/puro_cfms真核表达载体,脂质体法转染已融合表达GFP与STATl的人骨肉瘤细胞系。通过抗性筛选和有限稀释法,获得稳定表达人C-Fms的新型细胞系。利用含有
4500mg/L葡萄糖、10%胎牛血清、4mML-谷氨酰***、500μg/mLG418和2μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基,置于37°C,5%CO2,80%湿度培养箱中培养。与转染前相比,建立获得的细胞形态未发生明显变化,生长状态稳定。本实施例制备的细胞系(即本发明进行保藏的人骨肉瘤细胞株,)可作为筛选酪氨酸激酶或者评价化合物对酪氨酸激酶抑制活性的细胞模型。实施例2:新建立细胞系的鉴定利用重组表达的人M-CSF(hrM-CSF)处理实施例I制备的细胞系,激活c-Fms,诱导GFP-STATI发生核转位现象。所建立细胞系中的人巨噬细胞集落刺激因子受体与其特异性配体M-CSF结合后,受体形成ニ聚化,同时空间构象发生变化而活化激酶结构域。通过转磷酸作用,c-Fms下游的信号途径被激活。磷酸化的GFP-STAT1也形成ニ聚化,进入细胞核,发生核转位现象。为了定量检测hrM-CSF诱导GFP-STATI的转核程度,本实施例采用InCe11Analyzer1000或InCellAnalyzer2000获取GFP-STAT1转核的细胞图像,用细胞核转运分析模块(NuclearTraffickingAnalysisModule)分析得到的细胞图像,以转核指数(Translocationindex)表示GFP-STAT1的转核程度。转核指数等于姆孔获得细胞的细胞核平均荧光亮度与细胞质平均荧光亮度之比。具体步骤如下I)将细胞接种于黑色透底的96孔培养板,于37°C,5%C02,80%湿度培养箱中培养24
小时。2)用含有4500mg/L葡萄糖、4mML-谷氨酰***、%BSA和IOmMHEPES的无血清DMEM培养基(以下称细胞分析液)洗涤细胞2次,每次加细胞分析液100μL/孔。此后,カロΛ50μL每孔的细胞分析液。3)加入含有hrM-CSF的细胞分析液,50μL/孔,使hrM-CSF的终浓度为100ng/mL,于37°C细胞培养箱中孵育30分钟。4)用37°C预热IXPBS溶液稀释的8%甲醛溶液固定细胞,100μL/孔,室温避光放置20分钟。5)弃液,加入含有^^(*8セ33342的1\85溶液,20(^17孔,室温避光放置30分钟。6)利用InCellAnalyzer1000获取细胞图像,用细胞核转运分析模块分析GFP-STATI的核转位程度。在浓度为100ng/mL的hrM-CSF作用下,与没有表达人c_Fms的U20S-GFP-STAT1细胞相比,表达人c-Fms的U20S-GFP-STAT1/CSF-1R细胞中的GFP-STAT1发生了显著的核转位(图I)。实施例3:hrM_CSF诱导GFP-STAT1转核的半数有效浓度测定步骤如下I)将实施例I制备的细胞制成IXIO5个/mL的细胞悬液,接种于黑色透底的96孔培养板,100μL/孔。2)于37°C,5%C02,80%湿度培养箱中培养24小时。3)用细胞分析液洗细胞2次,每次100μL/孔;弃液,再加入50μL/孔的细胞分析液。
4)加入细胞分析液稀释的hrM-CSF,使其终浓度分别为1、3、10、30、100、300、600、1000ng/mL。5)37°C,5%C02,80%湿度培养箱中孵育30分钟后,加入37°C预热细胞固定液,