pcr扩增基因.pptx

文档介绍：【PCR 原理】
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法,其基本原理类似于DNA的天然复制过程。
反应包括: 变性(Denature) 、退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。
这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25~35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
加热
变性
复性
复温
DNA的变性和复性
加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。
解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。
PCR扩增原理
延伸
变性、退火
5’
3’
5’
3’
3’
5’
变性
退火
3’
5’
延伸
变性:加热,使模板DNA在高温下(94℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。
退火:溶液温度降至45~65℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶段。
延伸:溶液反应温度升至72℃,耐热DNA聚合酶以单链为模板,利用引物的3’-OH,以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)为底物,按5’-3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。
PCR的三个热反应过程
温度(℃)
时间(min)
94
72
60
94℃变性(1min)
60 ℃退火(1min)
72 ℃延伸()
循环1 循环2 循环3
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复始,重复进行,直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
PCR的产量
每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。
DNA产量以指数上升,n个循环后,达到2n拷贝。
【仪器耗材与试剂】
(一)仪器与耗材
1. PCR热循环仪
2. 20μL、 200μL 吸头,200μL、500μL EP管,10μL、 50μL、200μL移液器
3. PCR 电泳仪和电泳槽
(二)试剂
10×PCR Buffer;
MgCl2, 25 mmol/L;
dNTP( 其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP;每种浓度均为10 mmol/L );
正向引物与反向引物(10 μM/L);
Taq DNA聚合酶(1U/μL);

DNA模板(小鼠基因组DNA,100ng/μL , 反转录cDNA);
ddH2O
【实验步骤】
1. mL Eppendorff 管内配置20 μL反应体系:
反应物
体积(μL)
dd H2O
12
PCR缓冲液(10×)
2
MgCl2 (25 mmol/L)
2
dNTP (10 mmol/L )

正向引物( 10 μM/L )

反向引物( 10 μM/L )

Taq DNA聚合酶
1
模板DNA
1
2. 按下述程序进行PCR扩增:
1) 94℃预变性 3 min;
2) 94℃变性 1 min;
3) 55℃退火 30 sec;
4) 72℃延伸 30 sec;
5) 重复步骤2~4, 34次;
6) 72℃延伸 5 min;
7) 4 ℃, 3min.