文档介绍：PCR扩增基因
【仪器耗材与试剂】
（一）仪器与耗材
1. PCR热循环仪
2. 20μL、 200μL 吸头，200μL、500μL EP管，10μL、 50μL、200μL移液器
3. PCR 电泳仪和电泳槽
PCR扩增基因
【仪器耗材与试剂】
（一）仪器与耗材
1. PCR热循环仪
2. 20μL、 200μL 吸头，200μL、500μL EP管，10μL、 50μL、200μL移液器
3. PCR 电泳仪和电泳槽
（二）试剂
10×PCR Buffer；
MgCl2, 25 mmol/L；
dNTP（其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP；每种浓度均为10 mmol/L ）；
正向引物与反向引物（10 μM/L）；
Taq DNA聚合酶（1U/μL）；

DNA模板（小鼠基因组DNA，100ng/μL ，反转录cDNA）；
ddH2O
【实验步骤】
1. mL Eppendorff 管内配置20 μL反应体系：
反应物
体积（μL）
dd H2O
12
PCR缓冲液（10×）
2
MgCl2 （25 mmol/L）
2
dNTP （10 mmol/L ）

正向引物（ 10 μM/L ）

反向引物（ 10 μM/L ）

Taq DNA聚合酶
1
模板DNA
1
2. 按下述程序进行PCR扩增:
1） 94℃ 预变性 3 min；
2） 94℃ 变性 1 min；
3） 55℃ 退火 30 sec；
4） 72℃ 延伸 30 sec；
5）重复步骤2~4, 34次；
6） 72℃ 延伸 5 min；
7） 4 ℃, 3min.
3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
配制2％琼脂糖凝胶，取10 μL扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。
4. PCR的反应体系中各组分作用
DNA 模板 (template)
引物 (primer)
4种脱氧核苷酸（dNTP）
DNA聚合酶（Taq）
反应缓冲液
Mg2+及某些使酶稳定的辅剂
质量：要求有较高纯度的DNA样品
避免反复冻融，防止降解
数量: 25-100ng/20µl
1）DNA 模板
2）引物
与模板DNA的某个局域具有互补碱基特异性的短的单链DN***段。
3）dNTP
4种 dNTP 用量应均衡，否则会减少 Taq 酶合成的忠实性，增加错配率。
最初的聚合酶
大肠杆菌DNA 聚合酶 klenow 片段,
不耐热，每次加热变性后需重新补加。
聚合温度偏低（37 ℃ ），产生非特异性扩增
Taq DNA 聚合酶
从水生栖热菌中分离，可在70-75℃生长。
Taq 酶扩增效率: 600bp/min
错配率: 1bp/4000bp (无3’-5’外切酶活性)
4）DNA聚合酶
作用:
增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。
增加 dsDNA 的 Tm 值，提高融合温度。
与游离 dNTP 形成可溶性复合物，有利 dNTP 渗入。
浓度: - mmol/l
5）缓冲液中的Mg2+
6）循环次数
循环次数是25－35次。
循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增加。
5. PCR反应常见问题
1. 没有任何产物：
模板太少，模板含有大量杂质（蛋白，酶抑制剂）
酶失活或者忘记添加
引物设计，浓度
Mg2+浓度太低
变性时间太短，退火温度过高，延伸时间太短等
2. 产生多个条带：
引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高
Mg2+浓度太高
酶用量太多
退火温度过低等
:
模板或者试剂不纯，有其他基因组污染
4. 出现片状拖带：
模板，酶，dNTP用量太大，循环次数过多
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