文档介绍：生物化学和分子生物学实验
1 必须穿白大褂;
2 书包放在实验台的上层架子上;
3 实验报告在实验课后24小时内由组长统一上交;
值日生注意事项强调:
1 清洁实验台上层架子;
2 用湿抹布擦黑板
3 清洁比色皿;
4 将所有移液枪调到最大量程;
实验一分光光度法
可见光
可见光, 在400 - 760nm范围
光的吸收定律
To a specific wavelength,
L
A=KLC
(一)基本原理
分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。
Lambert-Beer定律,吸光度与溶液的浓度成正比,与光束通过溶液的距离(即光程)成正比,用数学表达式表示为:
A=KLC
C:物质的浓度,L:光程(cm),K为吸光系数或消光系数。
当一束单色光通过溶液时,一部分被吸收,一部分则透过溶液
入射光强度为I0,透射光强度为It,
则透光度T=It/I0, T%=It/I0X100%
吸光度(A)或光密度()或称消光度(E)
A=-LgT
三种管的作用:
标准管(Cs)
测定管(Cx)
空白管
由于单色光透过溶液时,不仅被待测物质所吸收,而且还被比色容器与溶剂以及其它试剂吸收一部分,这部分需用消除;
空白液的做法即用与样本相同的一切试剂,而不含被测定的物质。
空白管
(二)待测溶液的浓度计算
(1) 利用标准管法计算待测溶液的浓度:
(2) 利用标准曲线进行换算:
(3) 利用吸光系数(消光系数)求出待测溶液的浓度。
根据Lambert-Beer氏定律:A=KLC
若C为1%(g/ml),L为1cm,此时的K值称为百分吸光系数用E1%:C=A/E1%1cm
若C为1mol/L,L为1cm,其K值称为摩尔吸光系数用ε表示即;
C=A /ε
根据Lambert-beer定律:
标准管:As=KLCs (下标S:标准液)
待测管:Ax=KLCx (下标X:待测液)
L相等,温度相同,测定同一物质,所用单色光相同,则K相同,则: As/Ax=Cs/Cx 即Cx=Ax/As·Cs
在实际操作中,常使待测管体积与标准管体积相等(以X代表测定管含量,S代表标准管含量)则:
X=Ax/As·S
计算待测溶液浓度时,可根据测定时实际吸取的标准液的体积(Vs)和待测样品的体积(Vx),将上式演变为:
待测溶液浓度:Cx=Ax/As·Cs·Vs/Vx
利用标准管法计算待测溶液的浓度