文档介绍：分子生物学杨孝朴第七章基因工程1基因工程工具酶2分子克隆载体与宿主细胞3DNA文库建立4目的基因的获得5目的基因与载体的连接7重组体的筛选8克隆基因的表达6重组DNA分子导入受体细胞第七章基因工程基因工程兴起于20世纪70年代初。1972年BergP和他的同事将λ噬菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入猴病毒SV40DNA中,首次构建出DNA的重组体。由于SV40能使动物致癌,出于安全的考虑,这项工作没有进行下去。第二年,CohenS和BoyerH将细菌质粒通过体外重组后导入宿主大肠杆菌细胞内,得到基因的分子克隆,由此产生了基因工程。基因工程是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程,包括基因重组、克隆和表达。基因工程这个术语既可用来表示特定的基因施工项目,也可泛指它所涉及的技术体系,其核心是构建重组体DNA的技术,因此基因工程和重组体DNA技术有时也就成为同义词。,至60年代后期始证明存在修饰酶和限制酶,前者修饰宿主自身的DNA,使之打上标记;后者用以切割无标记的外来DNA。1970年SmithHO和WilcoxKW从流感嗜血杆菌中分离出特异切割DNA的限制性核酸内切酶,简称为限制酶。1973年Smith和Nathans提出修饰一限制酶的命名法:取分离菌属名的第一个字母,种名的前两个字母,如有株名也取一个字母,当一个分离菌中不只一种酶时,以罗马数字表示分离出来的先后次序。修饰性***化酶标以M;限制酶标以R。例如,Smith等最初分离到的限制酶因是第2个分离出来的酶,应称为R·HindⅡ,但R通常都省略不写;相应的***化酶则为M·HindⅡ。又如,***化酶为M·EcoRⅠ,限制酶为EcoRⅠ。限制酶的发现为切割基因提供了方便的工具,DNA重组才得以成为可能。修饰一限制酶主要有三种类型:类型Ⅰ酶为多亚基双功能酶,对DNA***化和切割由同一酶完成。该酶共有三种亚基,S亚基为识别亚基,识别位点分为两部分序列,中间隔以一定长度的任意碱基对。例如,EcoB识别序列为TGAN8TGCT,6GTGC。M亚基具有***化酶活性,R亚基具有限制酶活性,可在远离识别位点至少lkb以上处随机进行切割。当类型Ⅰ酶特异结合在识别位点上时,如果两条链均已***化则不发生反应,对半***化DNA(即一条链***化,另一条链末***化),可使末***化的链***化,在识别位点上两条链均末***化,则DNA被酶切割。由于切割是随机的,这类酶在基因操作中并无实际用途。类型Ⅱ酶的修饰和限制活性由分开的两个酶来完成。通常这类***化酶由一条多肽链组成,限制酶由两条相同的多肽链组成。类型Ⅱ酶的识别序列常为4~6bp的回文序列。***化酶能使半***化DNA识别位点上特定碱基***化,DNA两条链都已***化时无反应,两条链都末***化则被限制酶降解。限制酶的切割位点或在识别位点内,或靠近识别位点。类型Ⅱ酶是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶。类型Ⅲ酶为两个亚基双功能酶,M亚基负责识别与修饰,R亚基负责切割。切割位点在识别位点下游24~26bp处。大部分限制性核酸内切酶识别的DNA序列具有回文结构特征,不同的限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同,结果有三种不同的情况:①产生5′突出黏性末端:以EcoRⅠ为例:5′-CTGCA3′5′G-3′3′-G5′3′-ACGCTC-5′5′-G↓AATTC-3′3′-CTTAA↑G-5′5′-G3′5′-AATTC-3′3′-CTTAA5′3′G-5′②产生3′突出的黏性末端:以PstⅠ为例:5′-CTGCA↓G-3′3′-G↑ACGTC-5′③产生平末端:以KpaⅠ为例:5′-GTT↓AAC-3′3′-CAA↑TTG-5′5′-GTT3′5′AAC-3′3′-CAA5′3′TTG-5′由不同微生物分离得到的限制酶,如果识别位点和切割位点完全一样,称为同裂酶;如仅仅是黏性末端突出的单链相同,称为同尾酶。由同尾酶切割的限制片段彼此相连,不能再被原来的限制酶切割。例如:BamHⅠ的位点与限制片段BglⅡ的位点与限制片段连接后的序列与原来两个限制酶的识别序列均不相同,因此不能再为原来的酶所切割。G↓TAG↑GA↓GATCTTCTAG↑TAGA限制酶的生物学功能在于降解外来的DNA,自身DNA的酶切位点由于修饰酶的***化而受到保护。在基因工程操作中限制酶可作为切割DNA分子的手术刀,用以制作DNA限制酶谱,分离限制片段,进行DNA体外重组等,是十分有用的工具酶。限制片段常用凝胶电泳或高效液相层析(HPLC)法分离。如果DNA中的核苷酸序列是随机排列的,则