文档介绍：上海交通大学
博士学位论文
革兰阴性杆菌中新耐药基因和耐药机制的发现和研究
姓名:孙景勇
申请学位级别:博士
专业:病原生物学
指导教师:倪语星
20080501
革兰阴性杆菌中新耐药基因和耐药机制的发现和研究摘要革兰阴性杆菌是目前临床最常见的致病菌,而且其耐药性日益严重。目前针对革兰阴性杆菌耐药机制研究的最多和最深入的是其对荒邗0防嗪袜低@嗫咕药物的耐药。但在临床工作中我们发现了一些少见的耐药菌株或目前的理论无法解释的耐药现象:如对第三代头孢菌素和氟喹诺酮同时耐药的志贺菌、多重耐药的非、非霍乱弧菌、对哌拉西林/他唑巴坦等含酶抑制剂抗菌药物和头孢哌酮耐药而对头孢噻肟敏感的大肠埃希菌等,本研究对上述菌株进行深入研究,并且把耐药基因与其遗传环境有机联系起来,系统研究其耐药性转移的机制。产超广谱荒邗0访父J现竞鼐兄柿=榈嫉泥低D鸵┗騫发现和研究。本实验的目的是明确一株对第三代头孢菌素和氟喹诺酮同时耐药的福氏志贺菌的分子机制,了解质粒介导喹诺酮耐药基因的结构特征。通过接合试验了解耐药性是否由质粒介导;用直鹄┰鋈旧搴椭柿=榈嫉泥低D鸵┗虿⒔行序列分析,检测染色体介导耐药的突变位点和质粒介导耐药的基因型;用┰狹各组虿⒔行蛄蟹治觯觳釸所携带的基因型;对耐药质粒进行“鸟枪法”随机克隆实验并对插入到克隆载体的盖衅辖测序,检测和分析基因的上下游结构。结果显示:旧錎旋转酶亚基的位发现突变,而和未见突变;騜和喹诺酮耐药基因分别位于可接合质粒上;及其上下游序列的基因结构为“保守区域一猯男问健=崧郏罕臼笛槭状卧诠诘闹竞菌中检出质粒介导的喹诺酮耐药基因和甅一虴笳呓榈剂讼妇缘三代头孢菌素的耐药,前者可介导细菌对萘啶酸的耐药,而且其与C窯基位突变的联合作用可导致细菌对环丙沙星的耐药;的起源和扩散可能与插入序列有关,其上下游的基因结构主要有两种形式,而我国检出的菌株一、上述基因结构完全相同。上海交通大学博士研究生毕业论文
所携带基因盒的特征,我们通过煸黾觳獠煌掷嗟恼厦福挥贸て螾对整将耐药质粒经鶫虷双酶切后的片段插入到克隆载体表达并非、非霍乱弧菌中超广谱荒邗0访的发现和研究。本实验的目的是明确非、非霍乱弧菌中的基因型及其遗传背景,以探讨该耐药基因传播的机制。通过表型确证试验确定细菌是否产生,通过接合试验了解是否由质粒介导,通过┰龊托蛄蟹治鋈范‥幕蛐停ü聪騊和序列分析了解基因两侧的结构。结果显示:表型确证试验确认菌株为产菌株,接合试验证实基因位于可接合质粒上,⒎聪騊扩增和序列分析确定其基因型为,该基因上游序列为,下游为颉以上结果表明:我们首次在世界范围内从非、非霍乱弧菌中检出了—,而且首次发现该酶基因与一种新的基因元件嗔笳呖赡芙榈记罢的水平转移。三、两种新的耐药基因约籽踯朽つ鸵和粤疵顾兀彻霉素耐药姆⑾趾脱芯俊1臼笛榈哪康氖侨范ň闞中整合子的种类及整合子合子可变区全序列进行扩增,序列分析了解基因盒的数量和基因种类;通过靥宸直鸲哉献尤ǔ产物和基因盒进行克隆和表达。结果显示菌株捌浣雍献泳类整合子,其可变区包含三个基因盒,其中的基因分别为土街中碌幕颍饬街中禄蛩嗦氲牡鞍追直鹩隓和有%和%的一致性,整合子全长颰寺≈瓯硐治6岳F健⒓籽踯朽和链霉素/壮观霉素耐药,反向、正向插入载体的基蠺寺≈昃硐治6粤霉素/壮观霉素耐药。结论:本试验我们在世界上首次发现了两种新的耐药基因蠥籽踯朽つ鸵和疵顾兀彻勖顾啬鸵,它们位于可接合质粒上类整合子的基因盒中,而且基因盒含有独立的启动子序列。邗0访附榈嫉拇蟪ΠO>赃呃髁郑虬吞购屯锋哌咄D药机制的研究本实验的目的是探讨临床分离大肠埃希菌赃呃髁郑虬吞等含酶抑制剂抗菌药物和头孢哌酮的耐药机制。我们通过三相水解试验了解酶的水解特性,通过接合试验了解耐药性是否由质粒介导,通过“鸟枪法”随机克隆实验二、四、上海交通大学博士研究生毕业论文
埃希菌中/启动子调控测序,通过重叠延伸法定点突变及亚克隆了解启动子对耐药基因表达的影响。结果显示菌株械拿缚伤膺呃髁郑虬吞埂⑼锋哌咄#ú凰馔锋呶鞫头孢噻肟,而且其耐药性可通过质粒接合转移。,其启动子为/,该载体表达后对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮等耐药,启动子/经突变后变为,亚克隆表达后其对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮等表现为敏感。结论:,而且这种耐药基因位于转座子和质粒上,可通过接合转移扩关键词:革兰阴性杆菌,,整合子,质粒,喹诺酮耐药,启动子,耐药机制散。上海交通大学博士研究生毕业论文
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