文档介绍：PCR技术(六):PCR技术应用进展
PCR技术自1985年建立以来,发展之迅速、应用之广泛,,基于PCR的基本原理,许多学者充分发挥创造性思维,对PCR技术进行研究和改进,使PCR技术得到了进上步地完善,并在此基础上派生出了许多新的用途. 
原位PCR技术
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.
原位PCR是Hasse等于1990年建立的,实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上,并用多聚甲醛处理,再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后,96℃2min以灭活蛋白酶K.③PCR扩增:在组织细胞片上,加PCR反应液,覆盖并加液体石蜡后,直接放在扩增仪的金属板上,.④杂交:PCR扩增结束后,用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.⑤显微镜观察结果.
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,. 
连接酶链反应
连接酶链反应(Ligase chain reaction,LCR),是一种新的DNA体外扩增和检测技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增.
连接酶链反应是Backman1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明,,而申报专利,,提高连接反应的特异性,排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序.
,经变性-退火-连接三步骤反复循环,:在模DNA、DNA连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下,首先加热至一定温度下(94~95
℃)使DNA变性,双链打开,然后降温退火(65℃),引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口,如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补,DNA连接酶即可连接封闭这一缺口,则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行,每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板,,引物不能与靶序列精确结合,缺口附近核苷酸的空间结构发生变化,连接反应不能进行,也就不能形成连接产物.
LCR的引物是两对分别互补的引物,引物长度为20~26个,以保证引物与靶序列的特异性结合,LCR识别点突变的特异性高于PCR,其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合,(Tm),因而识别单核苷酸错配的特异性极高.
LCR的扩增效率与PCR相当,用耐热连接酶做LCR只