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专利名称:真菌***降低的耐旱玉米的制作方法
技术领域:
本发明公开了提供真菌感染抗性和在缺水应激下产量提高的转基因植物,以及产生和使用这样的植物的方法。
背景技术:
需要提供产量提高、具有耐旱性和真菌***(mycotoxin)抗性的玉米植物。发明概述本发明提供真菌抗性转基因作物,其中,真菌抗性由表达一种或多种提供缺水耐受性或耐热性的蛋白质的重组DNA赋予。这些蛋白质选自冷激蛋白、冷结合因子、NF-YB转录因子(Hap3CAAT盒DNA结合转录因子)或其组合。本发明的一方面提供黄曲霉***(aflotoxin)抗性玉米种子。本发明的另一方面提供一种通过由具有表达一种或多种提供缺水耐受性或耐热性的蛋白质的重组DNA的转基因植物产生玉米种子,而减少在含有空气传播的曲霉属(Aspergillus)、链格孢属(Alternaria)、镰孢属(Fusarium)和青霉属(Penicillium)真菌孢子的环境中生长的所述玉米种子中的真菌抗性的方法。本发明还提供了玉米细胞中的非天然玉米DNA,所述玉米细胞包含表达两种或多种选自细菌冷激蛋白、冷结合转录因子和NF-YB转录因子的蛋白质的构建体。在一个实施方案中,非天然玉米DNA包含表达枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)cspB蛋白的重组
DNA和表达玉米NF-YB转录因子蛋白的重组DNA。优选实施方案详述本文使用的“缺水”是指植物所需的水不能以植物所消耗的速度补充的时期。长期缺水俗称为干旱。如果有适应于植物的生长速度的地下水储备,缺乏雨水或灌溉可能不会立即产生水应激。在具有充足的地下水的土壤中生长的植物可以在没有雨水或灌溉的情况下存活,而对于产量没有任何不良影响。在干燥土壤中生长的植物很可能会受到最短的缺水期的不利影响。严重缺水应激可能会导致枯萎和植物死亡;中度干旱可以导致产量下降、生长受阻或发育延迟。植物可以从某些水应激时期中恢复,而不会显著影响产量。然而,授粉时期的水应激可具有不可逆转的降低产量的影响。因此,在玉米的生长周期中观察水应激耐受性的有用时期是在抽穗前的营养生长阶段后期。水应激耐受性需要与对照植物进行比较。例如,本发明的植物可以在缺水情况下存活而具有比对照植物更高的产量。在实验室和田间试验中,可以通过给予本发明植物和对照植物比最佳浇水的对照植物更少的水来模拟干旱,并检测性状的差异。合适的对照植物可以是用于产生本发明转基因植物的亲本系的非转基因植物。对照植物在某些情况下可以是包含空载体或标记基因,但不包含在被评估的转基因植物中表达的本发明重组多核苷酸的转基因植物系。在其它情况下,对照植物是表达具有组成型启动子的基因的转基因植物。在一般情况下,对照植物是与所测试的转基因植物相同的株系
或品种的植物,但缺乏表征转基因植物的赋予性状的特定重组DNA。这种缺乏赋予性状的特定重组DNA的祖先植物可以是天然的野生型植物、优良的非转基因植物或没有表征转基因植物的赋予性状的特定重组DNA的转基因植物。缺乏赋予性状的特定重组DNA的祖先植物可以是具有赋予性状的特定重组DNA的转基因植物的亲缘种(sibling)。这种祖先亲缘植物可以包含其它重组DNA。转基因“植物细胞”是指例如通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化,或通过使用重组DNA包覆的微粒轰击,用稳定整合的、非天然重组DNA转化的植物细胞。本发明的植物细胞可以是作为微生物或作为后代植物细胞存在的原始转化的植物细胞,该后代植物细胞再生为分化组织,例如,再生为具有稳定整合的、非天然重组DNA的转基因植物,或从后代转基因植物产生的种子或花粉。“转基因”植物或种子是指其基因组已经通过掺入重组DNA而改变的植物或种子,该重组DNA的掺入例如是通过转化、由转化的植物再生,或通过培育转化的植物而实现的。因此,转基因植物包括从转化过程获得的原植物的后代植物,包括用野生型植物或其它转基因植物培育的转基因植物的后代。可以通过将具有赋予性状的重组DNA的转基因植物中的性状属性与祖先植物中的性状水平进行比较来检测理想性状的提高。可以使用表达蛋白质以提供水应激耐受性和/或产量提高的
重组DNA有利地转化各种植物。具有水应激耐受性的尤其有用的转基因植物包括玉米(玉蜀黍)、大豆、棉花、油菜(芸苔)、小麦、水稻、苜蓿、高粱、草类、蔬菜和水果。“表达蛋白质”指的是细胞转录重组DNA为mRNA并翻译mRNA为蛋白质的过程。重组DNA通常包括5'调控元件(如启动子和增强子内含子)以及3'聚腺苷酸化位点、内含子、转运肽DNA、标记和本领域技术人员普遍采用的其它元件。“重组DNA”是指通过组合两个以另外方式分离的DN***段制备的DNA分子,例如,通过化学合成或通过利用基因工程技术操作分离的核酸片段。重组DNA可以包括外源DNA或只包括操作的天然DNA。在植物中表达蛋白质的重组DNA通常提供为具有启动子的表达盒,所述启动子在植物细胞中有活性,可操作地连接至编码提供缺水耐受性或耐热性的蛋白质(例如,冷激蛋白、冷结合因子蛋白或NF-YB蛋白质)的DNA,该DNA与提供聚腺苷酸化位点和信号的3'DNA元件连接。有用的重组DNA还包括表达一种或多种赋予除草剂耐受性和/或抗虫性的蛋白质的表达盒。表达冷激蛋白的有用的表达盒包含连接至编码枯草芽孢杆菌冷激蛋白B()的DNA上的水稻微管蛋白A启动子和水稻微管蛋白A聚腺苷酸化元件。表达NF-YB蛋白的有用的表达盒包含连接至编码玉米NF-YB蛋白质的DNA上的水稻肌动蛋白启动子和土壤杆菌转录物73'聚腺苷酸化元件。表达草甘膦除草剂选择性标记的有用的表达盒包含连接至编码草甘膦抗性
EPSPS蛋白质上的水稻肌动蛋白启动子和土壤杆菌转录物nos3'聚腺苷酸化元件。美国专利申请公开2005/0048566A1公开了水稻微管蛋白A启动子和3'元件;美国专利5,641,876公开了水稻肌动蛋白启动子;美国专利6,090,627公开了土壤杆菌3'聚腺苷酸化元件。植物病原体包括真菌,例如,引起白粉病(powderymildew)、锈病(rust)、叶斑病(leafspot)和枯萎病(blight)、立枯病(damping-off)、根腐病(rootrot)、冠腐病(crownrot)、棉铃腐烂病(cottonbollrot)、茎黑腐病(stemcanker)、枝黑腐病(twigcanker)、脉管枯萎病(vascularwilt)、黑粉病(smut)或霉病(mold)的真菌,包括但不限于镰孢属的种(Fusariumspp.)、层锈菌属的种(Phakosporaspp.)、丝核菌属的种(Rhizoctoniaspp.)、曲霉属的种(Aspergillusspp.)、赤霉属的种(Gibberellaspp.)、_ffiM白勺禾中(Pyriculariaspp.)、ffiM白勺禾中(Alternariaspp.)和疫霉属的种(Phytophthoraspp.)。真菌植物病原体的更具体的例子包括Phakosporapachirhizi(亚沙|、|大豆秀病)、高梁柄秀菌(Pucciniasorghi)(玉米普通秀病)、多堆柄锈菌(Pucciniapolysora)(玉米南方锈病)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)和其它镰孢、链格孢属的种、青霉属的种、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)和其它腐霉(Pythium)、立枯丝核菌
(Rhizoctoniasolani)、黄曲霉(Aspergillusflavus)(曲霉穗腐病)、Exserohilumturcicum(北方玉米叶枯病)、Bipolarismaydis(南方玉米叶枯病)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)(玉米黑粉病)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)(玉蜀黍赤霉(Gibberellazeae))、Fusariumverticilliodes(串珠赤霉(Gibberellamoniliformis))>()、()>Diplodiamaydis>Sporisoriumholci-sorghi、禾生束ll盘f包(Colletotrichumgraminicola)、玉f大斑病菌(Setosphaeriaturcica)>Aureobasidiumzeae、.病疫霄(Phytophthorainfestans)、大豆疫霄(Phytophthorasojae)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)。人类和其它动物的食品是真菌的主要潜在营养来源。多种真菌的孢子在空气中是常见的,如果条件适合,真菌可以寄居在食品上。真菌从其环境中摄取用于其成长和发育的营养。当能源耗尽时,次级代谢产物的产生增加,包括多种导致人类和其它食草动物中毒的化合物。当这些被称为真菌***的化合物被意外地随食物摄入时,它们是危险的。常见的***包括生物碱类、环肽类和香豆素类。这些化合物在极低的浓度时就具有活性,并具有快速的效应。这些***可能导致死亡。在亚致死量时,这些***还可能引发癌症,并影响食用
者的生理学。许多化合物是热稳定的,在烹调或处理食品后仍保持活性。损害潜力对于在加强条件(intensiveconditions)下保存的人类食物和牲畜食物特别重要。空气传播的已知产生极高毒性化合物的一些常见真菌包括曲霉属、链格孢属、镰孢属和青霉属。特别是在湿度高时,这些真菌可以在储存的谷物和动物饲料上生长。它们还可以在活的棉花、花生和玉米植物中生长,其中,宿主植物的群集(colonization)可以在种子成熟前发生。昆虫或环境损伤导致的应激可以促进活植物的真菌感染。参见,Cassel等人,“Aflatoxins-HazardsinGrain/AflatoxicosisandLivestock“,SouthDakotaStateUniversityCooperativeExtensionService,FS907,其中J艮告“也已发现低于正常的土壤水分(干旱应激)增加空气中的曲霉孢子的数量。所以,当干旱应激在授粉过程中发生时,增加的接种负荷(空气中的孢子)大大增加了感染的机会。另外,在授粉过程中影响植物生长的干旱应激、氮应激和其它应激可以增加曲霉真菌产生的黄曲霉***(aflatoxin)的水平。通常,曲霉在穗的未填充部分生长。”参见Xu等人,2003,“Progresstowarddevelopingstress-tolerantandlow-aflatoxincornhybridsforthesouthernstates“[摘要],16thAnnualAflatoxinEliminationWorkshopProceedings,第63页,其中报告
“耐旱和耐热的玉米在干旱应激下具有较少的玉米粒霉菌。,,参见Anderson等人,“ManagingDrought-DroughtAdvisoryforCornProduction",NorthCarolinaCooperativeExtensionService,AG519-13,其中描述“当作物遭受干旱时,曲霉实际上沿玉米穗丝向下移动,感染内核并产生***。任何防止玉米遭受干旱应激的行动会降低玉米粒中的黄曲霉***浓度。”Diener等人,EpidemologyofAflatoxinFormationbyAspergillusflavus,,25249~70也讨论了玉米通过穗丝的感染。公布的专利申请US2005/0097640A1公开了用于转化植物细胞以提供缺水耐受性的包含启动子和冷激蛋白的DNA构建体。美国专利5,892,009公开了用于转化植物细胞以提供缺水耐受性的包含启动子和冷结合因子的DNA构建体。公布的专利申请US2005/0022266A1公开了用于转化植物细胞以提供缺水耐受性的包含启动子和NF-YB转录因子(也称为Hap3转录因子)的DNA构建体。公布的申请也公开了将DNA构建体引入植物细胞的转化方法、从转化的细胞再生植物的方法和将重组DNA从再生植物渗入到其它植物系中的方法。本发明的植物可以用堆叠性状(stackedtraits)进一步增强,例如,具有由本发明公开的DNA表达产生的增强的农学性状结合除草剂抗性和/或害虫抗性性状的农作物。例如,本发明的基因可以与具有农学益处的其它性状如提供除草剂抗性或昆虫抗性的
性状堆叠,例如使用苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的基因以提供对鳞翅目(lepidopteran)、鞘翅目(coleopteran)、同翅目(homopteran)、半翅目(hemiopteran)禾口其它昆虫的抗性。植物对其的抗性有用的除草剂包括草甘膦除草剂、麦草畏除草剂、草***膦(phosphinothricin)除草剂、碘苯***(oxynil)除草剂、咪唑啉***类(imidazolinone)除草剂、二硝基苯***除草剂、吡啶类除草剂、磺酰脲类除草剂、双丙氨膦(bialaphos)除草剂、磺***除草剂和草铵膦(glufosinate)除草剂。,034,322、5,776,760、6,107,549和6,376,754能够提供堆叠的性状,参考美国专利5,250,515,5,880,275,6,506,599,5,986,。许多用重组DNA转化植物细胞的方法是本领域已知的,且可以用于本发明。两种常用的植物转化方法是土壤杆菌介导的转化和微粒轰击。美国专利5,015,580(大豆)、5,550,318(玉米)、5,538,880(玉米)、5,914,451(大豆)、6,160,208(玉米)、6,399,861(玉米)和6,153,812(小麦)说明了微粒轰击方法,且美国专利5,159,135(棉花)、5,824,877(大豆)、5,591,616(玉米)和6,384,301(大豆)描述了土壤杆菌介导的转化,本文引入所有这些文献作为参考。对于基于根癌土壤杆菌的植物转化系统,转化构建