文档介绍：复旦大学
硕士学位论文
人胰蛋白酶原-1和-2基因的克隆表达及胰蛋白酶原-2的活化
姓名:涂艳
申请学位级别:硕士
专业:微生物学
指导教师:朱乃硕
20030529
人胰蛋白酶原和一基因的克隆表达及胰蛋白酶原一的活化
缩写词表
英文缩写英文全称中文全称
淀粉酶
急性胰腺炎
苯甲酞精氨酸乙酷
二氨基联苯***
细胞外调控激酶
卫重组肠激酶
遗传性胰腺炎
单克隆抗体
主要组织相容性复合物
次***基三乙酸镍
蛋白酶活化受体一
磷酸盐缓冲液
聚合酶链式反应
胰蛋白酶原活化肤
细胞受体基因已位点
胰蛋白酶原
人胰蛋白酶原和一基因的克隆表达及胰蛋白酶原一的活化
中文摘要
急性胰腺炎是临床常见的急腹症之一,近年来重
型胰腺炎发病率逐渐增多,重型胰腺炎死亡率为,有并发症者死亡率可高
达。在急诊条件下,快速诊断急性胰腺炎存在困难。目前通常采用检测淀粉
酶的水平,但其敏感性和特异性由于非高淀粉酶血症的存在而不够理想。最近有
研究资料表明,急性胰腺炎病人血尿中胰蛋白酶原一的水平显著升高,可以作
为检测的指标。
胰蛋白酶原一均由个氨基酸组成,其中位氨基酸残基为信
号肤,位氨基酸残基为酶原活化成胰蛋白酶时被截去的活化肤
,序列为胰蛋白酶原的
异位活化是急性胰腺炎的始发环节,作为胰蛋白酶原的激活产物是胰腺炎的
早期预测和病情严重程度判断很好的指标。在正常人血清中胰蛋白酶原一的浓
度较酶原一高,胰腺炎时因炎症导致胰蛋白酶原渗漏到血循环中,同时由于肾
小管对酶原一的重吸收大于酶原一,尿液中酶原的水平比正常值高出百
倍,可以更灵敏而特异地检测急性胰腺炎。
胰蛋白酶原的基因工程表达目前国内尚无报道。我们从人胰腺噬菌体
文库扩增胰蛋白酶原一和一基因,通过对胰蛋白酶原一和一基因的端四个氨
基酸碱基修改为大肠杆菌偏爱的密码子,降低翻译起始序列中碱基含量,
预测二级结构等一系列基因工程改造,成功构建了蛋白端带有
亲和标记的和表达载体,在大肠杆菌中获得了
占总菌体的高表达。重组胰蛋白酶原一和一用柱纯化,然后进行
验证。由于胰蛋白酶原一具有更高的应用价值,我们重点对纯化的
胰蛋白酶原一进行复性,经肠激酶活化处理复性胰蛋白酶原一检测获得了胰蛋
白酶活性,比活性近个单位,表明基因工程生产的胰蛋白酶原复性
后具有天然构象,可以用作抗原制备单克隆抗体,并可用作标准对照及进行生物
学功能研究。
关键词胰蛋白酶原,急性胰腺炎,基因克隆,基因表达
人胰蛋白酶原和一基因的克隆表达及胰蛋白酶原一的活化
,
一
一
,
人胰蛋白酶原。和一基因的克隆表达及胰蛋白酶原一的活化
第一部分综述
胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶家族的重要成员之一,这一家族酶解作用的分子机
制是以丝氨酸残基的侧链作为酶活性中心的构成基团。胰蛋白酶的性质和活
性依赖于丝氨酸蛋白酶作用机制作为基础。
丝氨酸蛋白酶
蛋白酶是一组催化水解共价肤键的酶类,丝氨酸蛋白酶水解的机制是基于酶
中丝氨酸对靶肤键的亲核攻击见图。半肤氨酸,苏氨酸或天冬氨酸结合的水
分子或金属也能起到这一功能。许多例子中,在天冬氨酸形成的质子受体环境中
蛋白酶类的亲核攻击能力在存在组氨酸的情况下得到增强,同时排列有丝氨酸,
组氨酸和天冬氨酸的侧链构成了绝大多数丝氨酸蛋白酶的催化三角。
丝氨酸蛋白酶的活性位点为裂缝状,在这里多肤底物与之结合见图。许多
的丝氨酸蛋白酶都是首先以酶原的形式合成和分泌的,随之在蛋白酶解作用下被
激活,产生酶的活性位点的构象变化。丝氨酸蛋白酶是序列特异性的,在人体诸
多生理过程中发挥着重要的作用。
补体激活过程中,补体系统各成分通常多以非活性状态存在于血浆之中,当
其被激活物质活化之后,才表现出各种生物学活性。在补体固有成分和调节蛋白
中,共有个丝氨酸蛋白酶原。即因子因子和
因子。它们除彼此在氨基酸序列上有同源性外,还与非补体性丝氨酸蛋白酶如
胰蛋白酶和糜蛋白酶高度同源。
凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶,在凝血过程中起着控制作用,凝血首先
通过至少两条途径内源性和外源性途径反应的结果激活丝氨酸蛋白酶酶原,形
成了凝血酶原激活剂,然后凝血酶原激活剂将凝血酶原分成两部分,其中之一便
是凝血酶,凝血酶从纤维蛋白原和肤链上切下纤维蛋白肤和纤维蛋白肤
使之成为一种改变的分子纤维蛋白单体,然后聚合形成不溶性的纤维蛋白纤
维蛋白多聚体。
此外在各