文档介绍：实验一人外周血淋巴细胞总RNA的提取、电泳
一、实验目的
学****并掌握人外周血淋巴细胞总RNA的分离提取及琼脂糖凝胶电泳检测方法。
二、实验原理
细胞的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成,其中rRNA含量最多(占80%~85%)。在pH ,RNA相对稳定,碱性环境下,易分解。
RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外,环境中存在大量RNA酶,极易降解RNA,因而在RNA提取及相关分析实验中,如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。
在RNA相关实验过程中,须树立RNase-free思想:1)样品新鲜,保存得当,以强变性剂,防止内源性RNase;2)人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好****惯;3)空气中灰尘和细菌含RNase,应建立干净的操作环境;
实验介绍如何使用Takara公司的RNAiso Plus试剂来分离人外周血淋巴细胞的总RNA。 RNAiso Plus是一种酸性苯酚提取试剂,含有去垢剂,和使RNase失活的异硫***酸胍,它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性,防止RNA降解。(注意:RNAiso Plus具有强烈腐蚀作用,小心操作。)
三、实验材料、试剂与器材
1、人外周血淋巴细胞(5х106)
2、DEPC水溶液,PBS,TAE
3、***仿,异丙醇,乙醇均为分析纯
4、RNAiso Plus试剂购自Takara公司
5、无RNase的枪头(1000、200、20 ul),离心管(、 PCR管,、2ml、7ml离心管)。
6、PE手套、离心机
四、实验步骤

1)、塑料制品的处理:
-%的DEPC (焦碳酸二乙酯水)浸泡过夜:
必须保证塑料制品被水浸透,内部没有气泡,对于小枪头、、 PCR管,必要时应用枪逐个的用水灌注(这一步对于以后的实验保证非常重要,须小心操作)。
泡过夜后,用镊子逐个敲去管内的DEPC水,装于干烤过的烧杯,加锡箔纸密封杯口;尽量敲去枪头内的水,装于处理过的枪头盒,报纸包好。
121℃,30分钟高压灭菌,以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性,且抑制后继酶促反应,烘干,备用。
DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。具强挥发性,致癌物,因而使用时应在通风橱操作,需戴一次性手套,一次性口罩,小心操作。
2)、试剂的配制:
试验所用试剂也可用DEPC处理过夜,再高压灭菌,但 DEPC能与***和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理,可用DEPC处理的水配制,并尽可能用未曾开封的试剂,然后高压灭菌。
所需烧杯等必须干烤处理以后方可用。
-‰的DEPC水(三蒸水),磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜,121℃,30分钟高压灭菌。
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用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞(PBMC),体外培养
取5х106个体外培养的PBMC悬液置于EP管中,离心收集细胞沉淀
向EP管中加入1ml RNAiso Plus裂解细胞,用移液枪反复吹吸,直至裂解液中无明显沉淀
室温(15-30℃)静置 5 分钟,然后从核蛋白中分离 RNA
加入***仿(RNAiso Plus 的 1/5 体积量),盖紧离心管盖,混合至溶
液乳化呈乳白色,室温静置 5 分钟
12,000 g 4℃离心 15 分钟。从离心机中小心取出离心管,此时溶液分为三层,
即:无色的上清液(含 RNA) 、中间的白色蛋白层(大部分为 DNA)及带有颜色的下层有机相。
小心吸取上层无色水样层转移至一新EP管中
向上清中加入 -1 倍 RNAiso Plus 体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,
室温下静置 10分钟。
12000g,4oC离心10min,轻轻倒去上清
加入与 RNAiso Plus 等量的乙醇洗涤RNA沉淀一次,7500r/min,4oC离心5min
弃上清,倒置EP管,5-10min空气干燥(勿完全干躁,难再溶),加入20ul的DEPC水溶解沉淀
注意:异硫***酸胍是很强的蛋白变性剂,但它不能使RNA酶发生不可逆失活。因此,假如去蛋白后,样本被残余的RNA酶污染,这些酶会在变性剂去除后,重新恢复活性。因此,将水相中RNA彻底从有机相中分离出,并避免通过脏的容器和手套重新被蛋白污染,这点很重要。
3、琼脂糖凝胶电泳检测
1)、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后,以DEPC处理的水冲洗,备用;
2)、以DEPC处理的水稀释50хTAE(DEPC处理的水配制,高压灭菌)为