文档介绍：实验九 PCR扩增检测转基因大豆、玉米
【实验目的】
PCR扩增方法检测市场常见大豆、玉米产品是否含有转基因成分
培养学生的实验设计能力和创新能力
以大豆特异性内源基因大豆凝集素(Lectin)基因或者玉米特异性内源基因IVR为实验九 PCR扩增检测转基因大豆、玉米
【实验目的】
PCR扩增方法检测市场常见大豆、玉米产品是否含有转基因成分
培养学生的实验设计能力和创新能力
以大豆特异性内源基因大豆凝集素(Lectin)基因或者玉米特异性内源基因IVR为内参， 花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动子)、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)及外源基因5-烯醇***-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4-EPSPS)基因为靶基因检测大豆和玉米中的转基因成分。
【实验原理】
【实验步骤】 大豆、玉米DNA 提取--改良的CTAB法
称取样品，在研钵中充分研磨。加入1000μL CTAB提取液， Ep管中；向EP管加入4μL RNaseA，至于65℃水浴，过程中混匀3~5次，30min，12000r/min室温离心10min；取上清于新的Ep管中，加入等体积***仿：异戊醇(24: 1)，轻缓颠倒数次(或至于漩涡震荡器上混匀)，室温静置5min，室温12000r/min离心10min；重复加入***仿异戊醇一到两次 (过程中如上清液量太少，可适量加入三重蒸馏水)；取上清于新的Ep管(千万不要吸入下层液体)，再加入等体积的CTAB沉淀液，轻缓颠倒混匀后室温静置1h，15000 r/min室温离心10min；弃上清液，加入***化钠溶解沉淀，56℃温浴15min，期间轻摇EP管数次助溶；加入800μL -20℃无水乙醇，-20℃静置1h，15000 r/min室温离心10min；弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两三次后，在室温下自然风干用三重蒸馏水溶解储存于4℃。
【实验步骤】 基因组DNA浓度和纯度的鉴定
取5μL样品溶于95μL三重蒸馏水中，用 Biophotometer分析DNA的浓度，通过它对提取大豆DNA测OD值。并记录数据。由OD260nm/OD280nm判定基因组DNA的浓度，其比值在之间较好，符合PCR检测要求。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。 它包括: 变性(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
检测基因
引物序列
扩增片段长度
基因性质
大豆 Lectin
玉米 IVR
CaMV 35S
NOS
CP4 EPSPS
p1：5’-gcc ctc tac tcc acc ccc atc c-3’
p2：5’-gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg-3’(54 ℃)
p3：5’-ccgctgtatcacaagggctggtacc-3’
p4：5’-ggagcccgtgtagagcatgacgatc-3’ (56℃)
p5：5’-gat agt ggg att gtg cgt ca-3’
p6：5’-gct cct aca aat gcc atc a-3’
(54 ℃)
p7：5’-gaa tcc tgt tgc cgg tct tg-3’
p8：5’-tta tcc tag ttt gcg cgg ta-3’
(54 ℃)
p9：5’-ctt ctg tgc tgt agc cac tga tgc-3’
p10：5’-cca cta tcc ttc gca aga ccc ttc c-3’ (56 ℃)
118 bp
226 bp
195 bp
180 bp
320 bp
内源基因
内源基因
外源基因
外源基因
外源基因
主要试剂
Taq DNA polymerase 底物：10mMdNTP
引物对：1μmol/L PCR缓冲液 ddH2O
主要实验器材
PCR主要操作步骤
标记试管
加入各种试剂、混匀、离心（最后加酶）
设立PCR循环程序，进行扩增
标记PCR反应管
加入试剂
【实验步骤】
1. mL Eppendorff管内调制50 μL反应体系：
反应物
体积（μL）
dd H2O
PCR