文档介绍：第三军医大学
博士学位论文
大鼠视网膜干细胞生物学和电生理学特性研究
姓名:陈丽峰
申请学位级别:博士
专业:眼科学
指导教师:阴正勤
20061101
大鼠视网膜干细胞生物学和电生理学特性研究木摘要匀豢蒲Щ鹱手缒.,,对于这类疾病目前尚缺乏有效阻止病变进展和恢复视网膜功能的治疗方法。视网膜干细胞移植是新发展起来并具有广阔应用前景的治疗战略,其中关键性步骤是提供功能良好的视网膜干细胞。就视网膜干细胞的功能研究方面,目前有许多研究者从形态学及神经化学角度证实了视网膜干细胞增殖和分化特性,但是有关视网膜干细胞电生理学特性的研究,目前仅有关于早期和晚期视网膜干细胞电生理学特性研究的比较,而关于从视网膜干细胞到其分化成成熟神经元的过程缺乏系统的电生理学研究。采用分子生物学手段虽然能够了解每个细胞基因的位置和机能,但是并不能彻底研究神经元的电生理特性。众神经元的基本功能是信号传递,离子和离子通道是产生生物电信号的基础,也是细胞兴奋产生动作电位的基础。电信号在细胞内整合信息,动作电位沿轴突快速传递到末梢,形成生物体细胞间信息传递及神经元回路构建,因此研究视网膜干细胞不同分化阶段神经元样细胞的离子通道特点,对了解这些视网膜干细胞分化后的细胞能否具备神经元的基本功能具有非常重要的意义。膜片钳技术是一种以记录离子通道的电流来反映细胞膜上单一的蚨喔龅离子通道分子活动的新技术,从细胞水平观察离子通道机能,且在同一细胞上可观察不同通道的活动。因此对视网膜干细胞的研究如果仅采用分子生物学手段将具有一定局限性,若能将膜片钳技术与形态学、分子生物学等方法相结合,将有利于将视网膜干细胞的生物学特性和电生理特性结合起来,为研究视网膜干细胞提供强有力的理论依据。同时对视网膜干细胞向特异性视网膜细胞分化能力的研究,也是提供功能良好的视网膜干细胞的关键之一。另外,就视网膜色素变性疾病发展过程中是否存在内源性视网膜干细胞进行初步探讨,为寻求挽救视网膜色素变性患者的视功能新的治疗途径提供实验依据。本研究通过分离和培养胚胎大鼠视网膜干细胞,初步探讨特定发育阶段的视网膜外液微环境对视网膜干细胞分化的影响,分析视网膜干细胞不同分化阶段细胞电压门控离子通道的表达特点及其变化趋势,了解视网膜干细胞不同分化阶段细胞的电生理第三军医大学博士学位论文所周知,‘戈毕钅项目编号:“
学特性,以期探索视网膜干细胞功能分化的物质基础。并就视网膜色素变性疾病发展过程中是否存在内源性视网膜干细胞进行了初步研究。本研究在上述这些方面做了大量的工作,具体在以下四方面进行研究:第一部分视网膜干细胞的培养及冻存咛齑笫笫油ど窬上皮来源的视网膜干细胞培养、传代、冻存、复苏,并对复苏后的细胞进行生物学检测和能否进一步分裂增殖、分化的鉴定,为下面的研究工作做准备。本研究成功建立了培养大鼠视网膜干细胞的方法,获得了可自我扩增传代、性状稳定的视网膜干细胞,在血清诱导分化条件下可分化为多种表达视网膜神经元细胞、神经胶质细胞特异性标志物的细胞。掌握了视网膜干细胞有效冻存和复苏的实验方法,复苏后视网膜干细胞的存活率约为。%,细胞性状稳定不发生分化,仍具有自我增殖能力,且可以用血清诱导分化为不同的视网膜细胞。不同的冻存时间对其存活率没有影响。第二部分细胞外液微环境对视网膜干细胞影响的研究⑿律笫油は赴外液微环境对视网膜干细胞特异性诱导分化的影响本部分通过才嘌置分层培养大鼠视网膜干细胞和新生鼠视网膜混合细胞,同时以成年阶段炝浯鼠氖油せ旌舷赴6哉眨鄄焓油じ上赴姆只嚷时浠S捎诙呦赴庖相通,但细胞不发生接触,这样可以模拟新生和成年时段时的视网膜外液微环境,研究它们对视网膜干细胞诱导分化的影响。⑹油け湫允笫油は赴庖何⒒肪扯允网膜干细胞的影响将在低持校隦大鼠视网膜共培养,在扫描电镜下观察变性视网膜组织分泌物对视网膜干细胞迁移、分化的影响。新生大鼠视网膜混合细胞可能分泌某种物质,可以提高视网膜干细胞向光感受细胞的分化比率,而成熟大鼠视网膜混合细胞不具备此功能,可能与该阶段细胞分化信号途径的关闭有关系;变性视网膜上清液微环境对共培养的干细胞具有趋向诱导作用,并能诱导视网膜干细胞进一步分化,干细胞受到周围组织细胞及细胞外基质的作用和影响可趋向运动并诱导分化。第三部分视网膜干细胞不同分化阶段细胞电生理学特性检测培养大鼠视网膜干细胞,,系统和深入地研究大鼠视网膜干细胞分化不同阶段的电生理学特性,以期探索视网膜干细胞功能分化的物质基础。同时将新生鼠视网膜混合细胞外液诱导视网膜干细胞分化与%胎牛血清非特异性诱导分化的细胞进行了电生理学特性方面的比较研究。在对视网膜干细胞分化不