文档介绍：页眉... 页脚. 硫化叶菌的假定蛋白质基因的 PCR 扩增生 122- 1 刘昌陇 201 270502101 【前言】聚合酶链式反应简称 PCR (Polymerase Chain Reaction ),是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法。PCR 技术关键在于引物的设计,其目的就是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板 DNA 序列。引物的设计需要注意: ①引物长度在 18-35bp ,G+C 含量在 40%-60% 之间,内部无发卡结构; ②引物之间避免形成二聚体; ③引物 3’端和模板之间不应少于 12个连续碱基相匹配; ④在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片段,有时需要在引物的 3’端加上适当的酶切位点。【目的】从 NCBI 中获得 Sulfolobus solfataricus (12389bp) 硫化叶菌的 16SrRN A 的序列,其中 80— 709 片段是编码保留待定蛋白的位置,使用软件 Vector NTI Suite 找出适宜的酶切位点, 用特定的限制性酶切下,并电泳分离出该片段,选出合适的引物,实现 PCR 的扩增以及对该蛋白的分析。【材料】种类名称界门纲目科属 sulfolob us硫化叶菌古细菌泉古菌门热变形菌纲硫化叶菌目硫化叶菌科硫化叶菌属【工具】 Vector NTI Suite 是综合性蛋白核酸分析工具, 具有蛋白核酸序列分析、引物设计分析、序列显示等多种功能,本次报告利用其做引物的设计分析。【方案设计】(1) 目的片段的酶切:使用软件 Vector NTI Suite 找出适宜的酶切位点,用特定的限制性酶切下; (2 )电泳分析:将获得的各酶切片段进行电泳,分析选择何种酶以能获得适宜长度以及包含目的片段的酶); (3)按照要求找出合适的引物。页眉... 页脚. 【分析】 1. 找出合适的酶切位点: 将硫化叶菌的序列导入 Vector NTI Suite 中,本次所需目的基因为序列的 80-79 0 片段,通过软件找到合适的酶切位点,添加所有酶后所形成的酶切位点图如下: 我们需要的片段长度为 80-709bp, 由上图可知当用 BrfBI 酶切时,得到的片段长为 719 ,这样所得到的引物片段过短,显然不合适,因此考虑到所选的酶切位点最好能够形成粘性末端,可得适宜的酶有 AsuHPI(1-791) 、 BstAPI(1-889) 、 BstIZ316 ( 1-980 )等。页眉... 页脚. 2. 电泳分离酶切产物选取能够使目的基因片段从所有的酶切产物中分离出来的酶,那么酶切产物中不能存在和目的基因片段长度相近的片段。(1) 选择 BstAPI 酶,选择琼脂糖凝胶电泳 2h ,能找到较好的片段,在 1-88 9 之间,结果如下: 页眉... 页脚. (2)选择 AsuHPI 酶,选择琼脂糖凝胶电泳 ,能找到较好的片段,在1-79 1 之间,结果如下: 页眉... 页脚. 3. 根据酶切产物设计引物按照下图的要求设计引物: PCR Analysis #1: Product of length 727 (rating: 144) Contains region of the molecule from 80 to 806 Tm: C TaOpt: C GC: